肉牛屠宰加工涉及多道引发沙门氏菌扩散的高危工序，如宰前禁食引发肠道抑菌能力的下降、宰前粪便污染的扩散、待宰圈内动物交叉污染、机械去皮、去内脏过程中肠道的刺破、胴体清洗喷淋以及胴体与胴体、胴体与设备及操作人员的接触。因此，对肉牛屠宰过程中不同工序中分离出的沙门氏菌进行溯源分析，确定交叉污染的高危环节，并对关键环节设置干预措施，对于控制工厂内部沙门氏菌的污染、保证肉品安全具有重要意义。
相比于其他分子分型技术，脉冲场凝胶电泳（PFGE）作为分子分型的“金标准”，具有较好的重现性、与其他方法几乎一致的区分性及更为清晰且易分析的条带分布，加之全球范围内完善的分型数据库及标准化操作程序，使之成为屠宰企业致病菌溯源、获取基础流行数据的有效手段。来自山东农业大学食品科学与工程学院的董鹏程、张一敏、朱立贤*和罗欣*等人对屠宰线上6 个工序分离出的沙门氏菌使用PFGE法进行溯源分析，试图找到沙门氏菌在屠宰过程中交叉污染的关键工序，为肉牛屠宰企业设置关键减菌环节及规程提供理论依据。
01
48 株不同血清型沙门氏菌经过包埋、消化、酶切，最终电泳后均得到清晰的PFGE图谱，所有菌株均被有效酶切，并产生11～18 条20～1100 kb的条带。在所有菌株中共找到22 种（记为PT1～PT22）不同的PFGE型。标准菌株H9812酶切后所得到的电泳条带清晰、完整，所得图谱适合于进一步的聚类分析。
02
所有菌株最高相似度为100.0%，最低相似度为48.0%，在77.5%的相似度上将48 菌株分为I～V 5 个大簇，每一簇与分离工厂具有较强的相关性。来源于X工厂的29 株沙门氏菌分布于II、V两大簇，来源Y工厂3 株沙门氏菌位于第IV簇，来源于Z工厂的16 株沙门氏菌分布于I、III 2 个大簇。同一大簇内菌株全部为单一工厂分离，不同工厂（地域）之间未发现高度相似的PFGE型。
03
在93.0%的相似度下，所有菌株被分为14 个不同的亚簇（A～N），同一亚簇内菌株图谱使用肉眼较难区分。随着相似度的提升，同一大簇具有根据血清型进一步分化为不同亚簇的趋势，如第I大簇分化为A～C 3 个亚簇，每个亚簇包含1（如B、C亚簇）或2 种（如A亚簇）血清型。提高相似度至95.7%，含有多种血清型的亚簇进一步被分解为包含单一血清型的不同基因型（例如A亚簇分解为PT1～PT3 3 种基因型），与此同时，同种血清型的不同菌株也得到进一步分化。
04
以95.7%的相似度对来源于胴体的5 株沙门氏菌进行溯源分析，有3 株沙门氏菌（基因型PT8、PT11、PT13）追溯到了源头。在基因型PT8中，分离于喷淋后10号牛胴体的134-X-D10-AGO菌与137-X-A10-AGO、053-X-A09-AGO、067-X-A14-AGO、071-X-G09-AGO、136-X-G06-AGO菌有着相同的血清型和96.3%的相似性，而后5 株菌分别来自相同或不同动物的皮毛，由此推断喷淋后胴体的沙门氏菌（134-X-D10-AGO）很有可能来源于自身的皮毛（137-X-A10-AGO），而由于宰前动物之间的接触，来源于10号牛皮毛的沙门氏菌很有可能来自9号牛（053-X-A09-AGO）、14号牛（067-X-A14-AGO）的交叉污染。进一步向上进行溯源， 9 号牛的粪便（071-X-G09-AGO）极有可能是污染的最初来源。该溯源结果证实了屠宰加工企业内部存在粪便-皮毛-胴体的交叉污染途径。
05
除胴体污染外，分型结果显示宰前动物存在更为普遍和严重的粪便-皮毛、皮毛-皮毛的交叉污染模式。在基因型PT18中，来源于2、3、12、13号牛粪便的山夫登堡沙门氏菌和来源于11、12号牛皮毛的沙门氏菌具有96.0%的相似性；在基因型PT22中，来源于13号牛粪便的卡拉巴尔沙门氏菌和来源于2号牛皮毛的沙门氏菌具有相同的基因型，同样的结果在Z工厂也得到了证实（基因型PT1、PT5）。这些结果说明宰前动物存在严重的皮毛-粪便交叉污染。在基因型PT4中，分离于Z工厂的1、4、7号3 头牛皮毛的4 株阿贡纳沙门氏菌具有96.0%～100.0%的相似性；在基因型PT15中，同样是分离于1、7号两头牛皮毛的2 株德尔卑沙门氏菌具有96.3%的相似性，说明沙门氏菌在宰前动物中存在皮毛-皮毛的交叉污染模式。
06
相对于血清分型，本研究证实PFGE能够提供更高的分辨率，进而提供更为准确的追溯结果：虽然来自X工厂14号牛皮毛的两株沙门氏菌065-X-A14-AGO与069-X-A14-AGO来源及血清型均相同， 但是其PFGE 相似度仅为87.0%，且通过目视分析其图谱差异较大，说明14号牛皮毛存在多种基因型沙门氏菌的交叉污染。同样，基因型PT4和基因型PT13的相似度仅为50.9%，因此同工厂、同动物、同血清的来源于基因型PT4的012-Z-A07-AGO与来源于基因型PT13的017-Z-A07-AGO具有较大差异。该分型结果证实了Z工厂7号牛皮毛中存在多种PFGE基因型沙门氏菌，而引发该厂胴体污染的沙门氏菌620-Z-B08-AGO与基因型PT13的017-Z-A07-AGO具有较高相似性，而非与基因型PT4的其他4 株菌相似，进而排除了其来自于1号与4号牛皮毛的可能。
结 论
结果证实，PFGE比血清分型具有更高的分辨率，48 株沙门氏菌的PFGE图谱相似度为48.0%～100.0%，所有菌株在95.7%的相似度下划分为22 个基因型，不同工厂（地域）间未发现高度相似的基因型。宰前动物的皮毛和粪便间存在严重的交叉污染现象，部分来源于粪便、皮毛的沙门氏菌已经突破屠宰企业的防控屏障，对胴体（洁净区）造成了污染，具有进一步污染下游产品的可能性。因此，应加强宰前管理，减少宰前交叉污染对企业内部防控措施造成的压力，并对去皮后的胴体设置喷淋减菌的干预程序，以有效扼制沙门氏菌由动物胃肠道向屠宰线的传播。
