PC12细胞是从大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆的细胞株，具备神经细胞的特性，其可被神经生长因子（NGF）诱导分化成神经元形态，广泛用于神经退行性疾病的研究。本实验室前期的工作中，通过对核桃粕分离蛋白进行碱性蛋白酶定向水解、超滤、Sephadex G-25、Sephadex G-15和反相高效液相色谱分离纯化后，经电喷雾串联质谱仪鉴定出分子质量为610.416 6 Da的核桃源五肽Leu-Pro-Leu-Leu-Arg（LPLLR），来自吉林农业大学食品科学与工程学院、小麦和玉米深加工国家工程实验室的郭勇、秦汉雄、魏贞和闵伟红*等人在此基础上，对核桃源五肽进行过氧化氢诱导PC12细胞的保护作用及机理研究，为核桃抗氧化肽保护神经细胞的开发和利用提供理论依据。
1. LPLLR的质谱分析结果
从经电喷雾串联质谱仪鉴定出LPLLR的质谱图可知，其分子质量为610.416 6 Da，并由北京中科亚光生物科技有限公司进行化学合成（纯度99.75%）。
2. MTT细胞毒性实验结果
与空白组相比，LPLLR的浓度为25、50、100 μmol/L时，PC12细胞活力没有显着差异，说明在此浓度下对细胞无毒性作用，对PC12细胞生长繁殖无影响。但在LPLLR的浓度为200 μmol/L时，对PC12细胞活力有显着的抑制作用（P＜0.05）。因此，选取样品浓度为25、50、100 μmol/L进行后续实验。
3. PC12细胞氧化损伤模型建立
当过氧化氢浓度小于200 μmol/L时，对PC12细胞损伤不明显，细胞存活率在70%以上；当浓度大于300 μmol/L时，过氧化氢对PC12细胞损伤明显，随着浓度增加和刺激时间延长，细胞存活率降低，当刺激时间达到5 h后，细胞存活率降到10%以下。本实验主要研究LPLLR肽段在自然衰老模型中对神经细胞的保护作用，因此选取300 μmol/L过氧化氢刺激2 h建立损伤模型。
4. LPLLR对过氧化氢诱导PC12细胞氧化应激的保护作用
与空白组相比，模型组的细胞存活率高度显着降低（P＜0.001），说明模型构建成功。经LPLLR刺激后，各组细胞存活率随着LPLLR浓度的增加而逐渐升高，呈浓度依赖关系，说明LPLLR对氧化应激损伤的PC12细胞具有有效的保护作用。
5. LPLLR对PC12细胞内ROS水平的影响
与空白组相比，模型组中ROS的相对荧光强度高度显着升高（P＜0.001），说明模型构建成功。与模型组相比，添加LPLLR的实验组中ROS的相对荧光强度均显着降低（P＜0.001，P＜0.05），说明LPLLR能降低氧化损伤PC12细胞内的ROS水平。
6. LPLLR对PC12细胞内MDA含量的影响
与空白组相比，模型组中MDA的含量高度显着大于空白组（P＜0.001），说明模型构建成功。与模型组相比，添加LPLLR的实验组中除低浓度组外，中浓度和高浓度组的MDA含量均显着降低（P＜0.05）。
7. LPLLR对PC12细胞内SOD、CAT和GSH-Px活力的影响
与空白组相比，模型组SOD、CAT和GSH-Px的活力均高度显着下降（P＜0.001）；与模型组相比，添加LPLLR的实验组SOD、CAT和GSH-Px活力均显着提高（P＜0.001，P＜0.05）。由此表明，LPLLR能够增加PC12中SOD、CAT和GSH-Px的活力。
8. LPLLR对PC12细胞内ACh含量的影响
与空白组相比，模型组中ACh含量高度显着降低（P＜0.001），说明模型构建成功。与模型组相比，PC12细胞中ACh含量都随LPLLR浓度的增加而增加，呈浓度依赖性，其中，中浓度和高浓度组与模型组存在显着差异（P＜0.05）。
9. LPLLR对PC12细胞内NO浓度的影响
与空白组相比，模型组的NO浓度高度显着上升（P＜0.001）；与模型组相比，LPLLR实验组的NO浓度均高度显着下降（P＜0.001）。
10. LPLLR对PC12细胞中SOD2、NF-κB p65和iNOS蛋白表达的影响
与空白组相比，模型组中SOD2蛋白相对表达量显着降低（P＜0.05）。与模型组相比，LPLLR低、中、高浓度组中SOD2蛋白相对表达量均显着升高（P＜0.001，P＜0.05）。与空白组相比，模型组中iNOS和细胞质NF-κB p65蛋白相对表达量均高度显着升高（P＜0.001）。与模型组相比，LPLLR各浓度组中iNOS和细胞质NF-κB p65蛋白相对表达量均显着下降（P＜0.001，P＜0.05）。
结 论
LPLLR对PC12细胞无毒副作用，能显着提高受氧化损伤PC12细胞的存活率，降低细胞中活性氧和丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力和乙酰胆碱含量（P＜0.05，P＜0.001）。通过酶联免疫吸附检测法和Western blotting法检测NO分泌量和SOD2、核转录因子κB（NF-κB）p65、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达水平，发现LPLLR能显着降低NO分泌量并上调SOD2蛋白表达水平，下调NF-κB p65和iNOS蛋白表达水平（P＜0.05，P＜0.001）。表明LPLLR对氧化应激损伤的PC12细胞具有一定的保护作用。
