青蛤（Cyclinasinensis）属于软体动物门鳃瓣纲异齿亚纲帘蛤目帘蛤科，含有高含量的蛋白和不饱和脂肪酸，味道鲜美，具有很高的营养价值。酶法提取生物活性肽具有特异性强、效果好、副反应少、能耗低、易于被人体吸收等优点，并且酶法水解蛋白还因具有安全性高、价廉、易于推广等特性而成为当前研究的热点。然而，目前关于提取青蛤抗肿瘤活性多肽的报道并不多，来自浙江海洋大学食品与医药学院的张亚茹、杨最素和浙江海洋大学东海科学技术学院的闫海强、龚戬芳*等人采用蛋白酶酶解青蛤内脏，采用正交试验方法获得最佳酶解条件，经分离纯化筛选出活性多肽，探讨其体外抗人前列腺癌DU-145细胞的活性，以期为青蛤活性多肽的制备及其抗癌作用研究提供实验依据。
1、酶解条件的优化
1.1 5 种蛋白酶的酶解结果
木瓜蛋白酶酶解物的ANN含量最高，达到了（7.00±0.35）mg/g，碱性蛋白酶次之。说明木瓜蛋白酶对青蛤内脏的水解效果最好，故选定木瓜蛋白酶为本实验最佳酶。
1.2 木瓜蛋白酶酶解青蛤内脏的正交试验结果
从抑制率大小可知，5 个因素对酶解效果皆有影响，由极差（R）大小得D（温度）＞B（pH值）＞E（时间）＞A（料液比）＞C（加酶量），且A4B4C4D1E2组合效果最好，即料液比1:4、pH 7.0、加酶量1500 U/g、温度45.0 ℃、酶解时间4 h。每个实验重复3 次，所得结果均为此组合效果最佳，即正交试验结果具有可靠性。
2、酶解液的分离纯化结果
2.1 超滤截留结果
小于3 kDa的酶解液对DU-145细胞的抑制率最高，达到（89.46±4.47）%。故选定小于3 kDa酶解液进行下步分离纯化。
2.2 Superose 12 10/300 GL层析分离纯化结果
MTT法显示峰1对DU-145细胞的抑制活性最高。
2.3 HPLC法分离制备及纯度检测结果
选取保留时间约为12 min的峰组分（峰面积16.32，峰高1999.79）进行收集，经N端测序得出该肽的氨基酸序列为：Ile-Leu-Tyr-Met-Pro，分子质量635.82 Da，命名为CSP。收集12 min时峰纯品再次采用HPLC法检测纯度，在280 nm波长处约7 min时出现主要单一峰。
3、细胞增殖抑制实验结果
随CSP质量浓度的增加和作用时间的延长对DU-145细胞的增殖抑制率明显上升。当CSP质量浓度为2 mg/mL、作用时间为24 h时抑制率为（9.89±0.49）%；而当CSP质量浓度为15 mg/mL、作用时间72 h时抑制率达到（84.17±4.21）%，IC50为（5.36±0.27）mg/mL，与对照组相比差异显着（P＜0.05）。
4、细胞形态结果
对照组DU-145细胞形态饱满、生长良好，视野下细胞数目较多；2 mg/mL组细胞间隙增大、轮廓模糊；而高质量浓度（12 mg/mL）组细胞变圆、变亮，形态更加不规则，细胞数目明显少于对照组，同时可见较多悬浮在培养液中的死细胞。
5、荧光染色结果
对照组细胞核呈现出淡蓝色荧光，且细胞形态规则；而CSP作用后可见个别细胞核皱缩呈亮蓝色；随着质量浓度的增加，视野中细胞数减少，部分核呈碎片状或点状且形态不规则，蓝色荧光增加，同时出现了凋亡小体。
6、ROS检测结果
对照组出现极少量的绿色荧光；与对照组比较，经CSP作用后荧光强度明显增加，且随着质量浓度的增加荧光强度依次增强。这表明DU-145细胞内ROS的产生量随着CSP质量浓度的增加呈明显增加趋势。
7、细胞微观形态结果
对照组DU-145细胞培养24 h后可见细胞表面有微绒毛，胞核形态规则，具有完整的核膜，染色质均匀分布，含有一个核仁。CSP处理后细胞的超微结构发生明显改变，染色质电子密度增高并浓缩聚集至核膜边缘，部分细胞膜有“出芽”现象，出现凋亡小体；随着CSP质量浓度的增加，细胞的微绒毛消失，细胞质内可见大量空泡形成，并出现了大小不一的自噬体，细胞核固缩明显，表现出凋亡细胞的特点。
8、细胞线粒体膜电位变化结果
右上象限表示正常的膜电位比例，右下象限表示下降的膜电位比例。与对照组相比，2、8 mg/mL和12 mg/mL组膜电位下降率分别为12.12%、20.71%和25.07%。随CSP质量浓度的增大，线粒体膜电位下降率随之增大，即发生细胞凋亡的细胞数呈显着性增加趋势。
9、nm23H1蛋白的表达结果
nm23H1蛋白阳性表达为细胞质内出现棕色结构对照组大部分细胞胞浆内呈浅棕色，个别细胞呈现阴性。随着CSP质量浓度的增加，视野下的细胞数量明显减少，细胞质内的阳性部位颜色逐渐加深，出现了巨核细胞，部分细胞核呈固缩状态。
结 论
制备青蛤多肽最佳酶是木瓜蛋白酶，最佳酶解条件是料液比1:4、pH 7.0、加酶量1500 U/g、温度45.0 ℃、酶解时间4 h；所得多肽对DU-145细胞的增殖具有明显的抑制作用，且呈时间与剂量依赖性；处理后的DU-145细胞出现凋亡的形态学特征；其质量浓度和细胞内ROS的表达量呈正相关关系；线粒体膜电位降低率从4.22%提高到25.07%；免疫组织化学法结果显示nm23H1蛋白的表达量增加。青蛤多肽能明显抑制DU-145细胞的增殖，并通过诱导其发生凋亡而发挥作用。
