2. DAB 显色时间需要达到最优化, 镜下观察达到阳性染色明显但背景不太 深。
3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸 索。尤其一抗孵育最好在 4 度过夜。
4. 切片脱蜡和水化要充分;加反应 液时要覆盖组织充分;每次加液前甩干 洗涤液,但又防止干片;用组化笔画圈 时尽量画大一点,否则墨水排斥液体, 引起片周边干片。
5. 片子着色不均匀的原因如下:① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min ,立即放入新鲜的 xylene1; ② 水化不全。应经常配制新鲜的梯度 乙醇;
③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一 抗 /二抗等试剂;
④ 抗体孵育时,切片放倾斜;
⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不 平,切片倾斜。
6. 一抗从 4 ℃拿出后,为什么有人说 要 37 度复温,目的是什么?
① 一方面, 防止切片从 4 ℃直接放入 PBS 易脱片; ② 另一方面,使抗原 抗体结合更稳定。一般不需要 , 但对表达 较弱的抗原可能有用 ,4 ℃和 37 ℃度
时分子运动方式不同 , 前者分子碰撞机 率和运动速度小于后者 , 后者结合更快 , 但敏感性也提高了并易造成非特异染 色。
7. 切片染色后背景太深,不易区分特异 性与非特异性着色?
① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易 增加背景着色。这可通过缩短一抗 /二抗 孵育时间、稀释抗体来控制;
② 一抗用多克隆抗体易出现非特异性 着色,建议试用单克隆抗体看看; ③ 内源性过氧化物酶和生物素在肝 脏、肾脏等组织含量很高,需要通过延 长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背 景染色;
④ 非特异性组分与抗体结合,这需要 通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭 时间和适当增加浓度来加强封闭效果; ⑤ DAB 显色时间过长或浓度过高; ⑥ PBS 冲洗不充分, 残留抗体结果增 强着色;
⑦ 标本染色过程中出现干片,易增强 非特异性着色。
