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SDS-PAGE染色液的配制及蛋白上样量的选择

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-07-05
核心提示:染色液和脱色液的配置
   染色液和脱色液的配置
 
  考马斯亮蓝染色液 1000 mL:
 
  先称取考马斯亮蓝R250  1.0 g  于1000 mL试剂瓶内,加入甲醇450mL溶解,再加冰醋酸100 mL和双蒸水450 mL至大约1000 mL。室温可放置12个月以上。染色液可倒入专用的回收试剂瓶,届时加入适量甲醇、考马斯亮蓝和大约10 g/L的三氯乙酸后可重复使用。
 
  考马斯亮蓝脱色液 10 L:
 
  于10 L洁净塑料桶内装入工业乙醇2 L,冰醋酸500 mL,加入去离子水至10 L,混匀,室温可放置12个月以上。
 
  蛋白电泳凝胶的快速染色和脱色:
 
  凝胶的染色和脱色于合适体积的塑料盒中进行。电泳后的凝胶加入染色液(以刚没过凝胶即可),于微波炉加热约40-70 sec至染色液刚刚沸腾(注意塑料盒的盖子不要盖的太紧以防染色液爆沸出),然后于脱色摇床上继续染色约10 min即可。染色液请倒入专用的回收容器内。以自来水小心地淋洗凝胶冲去剩余染料,然后倒入适量的脱色液,微波加热至刚沸腾后于染色摇床上摇动约10 min,倒掉脱色液,此时凝胶的蛋白条带即可看清。重复以上脱色步骤一次,即可看清电泳条带。扫描凝胶蛋白条带需要完全脱掉背景颜色,这需要重新换上脱色液室温摇床脱色2 h以上。
 
  蛋白上样量的选择
 
  要根据具体情况决定,对于考马斯亮蓝染色,如果样品为菌体蛋白样品,有至少50条以上的条带要显出来,需要上样量在15 μg左右即可,如果蛋白条带少于6条,如蛋白Marker或纯化阶段后期的蛋白样品,上样量可减少至2 μg即可显出清晰的条带。【简化成大肠杆菌上样,大约等于5.0个OD600上样10-15 uL左右】
 
 
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