河北农业大学食品科技学院的霍 超、卢海强、桑亚新*等人对B. pumilus E-1-1-1来源的cotA基因克隆表达，并对重组酶的酶学性质进行表征，进一步探究了 CotA漆酶在AFM1降解中的潜力，这为生物法降解AFM1提供了新的理论支持。
1、生物信息学分析
使用cotA-PF、cotA-PR为引物，以B. pumilus E-1-1-1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的特异性条带与pEASY-T1载体连接构建pEASY-T1-cotA质粒，质粒转入Trans1-T1感受态细胞后对阳性克隆子进行测序。分析测序结果得到B. pumilus E-1-1-1来源的cotA基因长度为1486 bp，编码495 个氨基酸，不含信号肽，相对分子质量约58 kDa，理论等电点为5.94。
2、CotA漆酶的表达及纯化
对质粒pEASY-T1-cotA和pET-30a（＋）进行双酶切，使用T4 DNA连接酶连接双酶切产物，热激转化E. coli（DE3），构建重组质粒pET-30a-cotA，阳性克隆经测序后，结果正确。用构建好的pET-30a-cotA重组表达载体，在E. coli（DE3）中采用低温诱导法进行表达活力达到367 U/L。
3、CotA漆酶酶学性质的表征
动力学曲线回归方程为y =3.794x＋1.2576，R2＝0.9935，该曲线拟合良好，可以作为反应动力学参数计算的方程模型。由回归方程可计算得：Km为3.01 mmol/L，Vmax为0.795 mmol/（L·min）。
4、CotA漆酶降解AFM1能力
将人工污染牛奶与CotA漆酶37 ℃贮存72 h后，AFM1的降解率为54.3%。以72 h作为降解AFM1的终点，是由于在已报道的生物降解黄曲霉毒素研究中降解终点的时间设置上有很大不同，但细菌降解时间3 d（28～37 ℃），真菌降解时间7 d（25～30 ℃）为较普遍条件。
5、不同时间降解产物的毒性分析
使用CotA漆酶处理24 h后细胞存活率由AFM1对照组的81.5%上升到87.0%，72 h后上升到93.6%。AFM1细胞毒性的主导机制是DNA氧化损伤，其相互作用取决于细胞接触的AFM1浓度，在较高质量浓度下，AFM1由于其亲脂结构很容易被结合到细胞膜上，并以协同的方式发挥其细胞毒性。在CotA漆酶作用下AFM1对肝癌细胞的毒性减小说明AFM1浓度降低，同时证明CotA漆酶能够有效脱除AFM1 。
结 论
对黄曲毒素解毒cotA基因进行异源表达，继而获得高活性的黄曲毒素降解酶，是生物法降解黄曲霉毒素的重要研究方向。本研究从B. pumilus E-1-1-1中克隆得到总长为1486 bp的cotA漆酶基因，并使用大肠杆菌成功表达，纯化获得的CotA漆酶蛋白最适温度为40 ℃，最适pH值为4，60 ℃半衰期为6 h，pH 9条件下半衰期为8 h，对有机溶剂和NaCl具有相当大的耐受性。CotA漆酶对牛奶中的AFM1有很强的降解效果，降解率达54.3%，降解产物毒性显着降低。实验结果证明生物酶CotA可以有效降解AFM1并且不会产生其他有毒物质。目前，CotA漆酶还需要继续进行基因优化，进一步提升该酶的应用潜力。
