来自宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所，国家枸杞工程技术研究中心的赵建华、尹 跃和宁夏农林科学院荒漠化治理研究所的李浩霞等人以‘宁杞1号’枸杞果实为材料，基于枸杞果实转录组测序数据，从枸杞果实中克隆LbxylA的cDNA全长，诱导重组质粒pGEX4T-1-LbxylA在大肠杆菌中表达，并对得到LbxylA融合蛋白进行多克隆抗体制备，有助阐明该基因在果实糖积累过程中作用机理，为进一步改善枸杞果实品质及转基因植株标记选取提供理论依据。
1、LbxylA克隆分析
基于枸杞转录组差异表达数据比对分析，发现TR29089|c0_g1的EST基因在枸杞果实发育过程中FPKM值呈现出显着差异。以该EST序列设计特异性引物，并从枸杞果实的mRNA反转录产物中获得LbxylA基因片段，测序结果为1446?bp，含有一个1446?bp的ORF，编码有348 个氨基酸，其理论等电点和分子质量分别为5.37?kDa和53.54?kDa，该基因的氨基酸序列分子式为C2405H3692N644O709S18。
2、LbxylA所编码氨基酸序列及进化树分析
进一步使用NCBI Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对其结构域进行分析，发现该基因Asn17～Leu481位氨基酸序列与木糖异构酶结构域（PLN02923）有较高相似性，其E-value为0×100 。该蛋白具有木糖异构酶显着特征，同时在序列中发现了可能的酶活性位点（His147）以及7 个金属离子结合位点，分别为Glu277、Glu313、His316、Asp341、Asp352，跨膜区域疏水区锚定到ER膜（其可信度系数为5.5）。
3、重组质粒pGEX4T-1-LbxylA的构建与鉴定
将PCR产物酶切纯化后，连接至pGEX4T-1载体多克隆位点，转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR和双酶切验证，均能检测到目的条带，且测序结果正确，表明重组质粒pGEX4T-1-LbxylA构建成功。
4、枸杞融合蛋白在大肠杆菌中的表达及抗体制备
重组质粒pGEX4T-1 -LbxylA得以表达，且在77?kDa左右的位置有特征蛋白条带出现，与理论大小76.2?kDa基本相符，说明融合蛋白中LbxylA蛋白得到表达。进一步发现1号克隆和3号克隆的表达水平相对较高，随后选取1号克隆进行下一步研究。
5、枸杞果实中LbxylA表达分析
随着果实发育进程LbxylA相对表达量整体呈现出下降的趋势，其中，在果实发育前期（开花后约0～15 d）果实中LbxylA表达量急剧下降，但在果实发育中后期（开花后约22～36 d）果实中的LbxylA表达量维持着恒定水平。
讨 论
研究发现，在细胞体内木糖异构酶将木糖异构化为木酮糖，被应用在木质纤维素微生物发酵生产乙醇；另外，在体外木糖异构酶可将葡萄糖催化为果糖的异构化反应，这被大规模应用于高果糖浆的工业生产。将细菌的xylA基因导入到马铃薯块茎后，马铃薯块茎中己糖组成发生改变，从而对马铃薯的新陈代谢产生一定的影响。在本研究中，在果实的发育前期，果实中LbxylA的蛋白水平滞后于该基因相对表达量，但在果实发育中后期两者变化相一致，这表明枸杞果实发育的不同阶段LbxylA由于基因翻译及翻译后加工，使该基因存在时空间的差异，此外，LbxylA变化是否还与果实中糖含量高低有关，有待于进一步研究。
