细菌内毒素（脂多糖，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分。人们在研究革兰氏阴性菌血症和内毒素血症的过程中，发现细菌内毒素在其中起着关键的作用，内毒素使机体免疫功能严重受损，进一步的发展可能引发脓毒性休克，弥散性血管内凝血，急性呼吸窘迫综合症，全身炎症反应综合症或致命性多器官功能衰竭。因此，内毒素的去除对于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的，尤其对于基因药物、蛋白药物、单抗克隆药物、生物疫苗、小分子化学药物等生物制品的下游纯化处理来说就显得非常重要。
细菌内毒素具有很强的耐热性和化学稳定性，100℃ 以下无大变化，在 120℃ 高温下加热 4 小时仅能破坏 98%，要完全灭活需在 180℃ 高温下，加热 2 小时以上，这样的方法进行内毒素去除有相当难度。一般化学药品不影响细菌内毒素的活性，只有强酸、强碱或强氧化剂可以破坏细菌内毒素。
内毒素去除
细菌内毒素去除的原理
因细菌内毒素体积小，耐热性及化学稳定性强，所以一般的过滤、加热和化学方法不易去除或灭活内毒素。现比较常用的内毒素去除方法多为超滤法或亲和层析法。本试剂盒使用的是一类高效内毒素去除树脂，它以生物安全性极高的内毒素特异吸附物质为配体，经此亲和树脂纯化，样品最终的内毒素水平可低于 0.1 EU/ml。而且经过亲和纯化后没有对人体有毒有害物质残余，适合抗体、疫苗等生物制品的内毒素去除。
内毒素去除实验操作
亲和层析内毒素去除的方法操作较简单，具体操作如下：
样品处理：样品在上样前建议离心或用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。样品 PH 最好控制在 7-8，是内毒素结合至柱子上最佳 pH 条件。样品最好控制适当的离子强度，减少非特异性吸附，如 0.15-0.5M 的 NaCl。
活化树脂：将预装柱置于铁架台，垂直固定，去除预装柱顶部的盖子，打开流速控制器，使保护液在重力作用下流干，加入 5ml 再生缓冲液（预冷），调节流速控制器，保持流速在 0.25ml/min（或者 1 滴/6s），待再生缓冲液流干，再加入 5ml 再生缓冲液（预冷），再重复操作两次，确保体系保持无热原存在。即使是第一次使用也必须进行这一步操作。这步操作大约需要 60 分钟完成。
平衡树脂：活化完毕，加入 6ml 平衡缓冲液（预冷），沿柱管内壁均匀加入其中，保证清洗柱管的内壁，调节流速控制器，保持流速在 0.5ml/min（或者 1 滴/3s），流干平衡缓冲液，再按此操作重复两次。这步操作大约需要 40 分钟完成。
内毒素去除：2ml 样品加到平衡后的层析柱中，调节流速在 0.25ml/min（或者 1 滴/6s），不接收流出液。当样品流完，继续添加样品，样品可以加满柱管，同时收集流出液，即为除热原的样品。为了降低样品的损失，样品流完后，再添加 2ml 平衡液，并与之前的流出液合并。检测样品浓度及内毒素水平。
再次使用：如果流出样品内毒素水平未能达到预期值，需要将预装柱按照步骤 2、3 重新再生、平衡，然后上样纯化。
保存条件：如果预装柱用完后需要保存，先用 10ml 平衡缓冲液（预冷）平衡柱子，待平衡液流干，加入 10ml 20% 乙醇溶液并于 4℃ 保存。
内毒素去除亲和填料的注意事项
内毒素去除用的亲和填料每次使用前都需用再生液和平衡液处理；
实验过程中使用的相关溶液和器具均要除热原，防止引入内毒素污染；
适当延长填料与样品溶液的处理时间可以加大内毒素的吸附量；
样品如果本身是带负性电荷，为增加样品回收率，样品中可以加 0.2M NaCl；
样品 pH 在 7-8 范围内，可以提高内毒素去除效率同时减少非特异性吸附；
样品内毒素如果一次去除不完全，可以重复，直到合格为止；
亲和填料保存条件为 20% 乙醇，4~8℃。
内毒素去除实验常见问题
问题可能原因解决方法
内毒素去除效率低样品 pH 值不在内毒素结合范围内用 0.1M NaOH 或 0.1M HCl 调节 pH 值至 7-8
样品和亲和树脂的接触时间太短降低流速，增加样品接触时间
去除或检测系统受到外来因素污染所有实验用品均需除热原，保证体系不受污染
内毒素与目的蛋白结合太牢固1. 优化样品的 pH 值，使它们解离
2. 增加样品与亲和树脂的接触时间
样品损失高样品通过非特异性作用结合在亲和树脂上增加样品和平衡中 NaCl 浓度
目的蛋白与内毒素结合牢固，一起结合在树脂上1. 优化样品的 pH 值，使它们解离
2. 增加样品与亲和树脂的接触时间
样品被污染树脂用于处理过其他的样品尽量避免使用同一个预装柱处理不同样品。如果无法避免，可以在处理一个样品之后，用 10-20ml 2M NaCl 淋洗树脂，然后再处理另外一种样品
内毒素检测
内毒素检测原理：利用鲎试剂能与内毒素产生凝聚反应的特点，来检测内毒素的含量。
内毒素检测流程图
阳性样品对照溶液的制备：将 5MVD 倍的样品 1.0ml 与 4λ 浓度的内毒素标准溶液混合制成 2λ 浓度的内毒素溶液；
取 8 只鲎试剂，每支加入 1ml BET（细菌内毒素检查用水）溶解；
取其中两支作为对照管分别加入 0.1ml 内毒素标准溶液，2 支加入 0.1ml 混合制成 2λ 浓度的内毒素溶液，2 支加入 0.1ml BET 作为阴性对照，2 支加入 0.1ml 样品，将 8 支试剂混匀，封口并放入 37 摄氏度恒温水浴 60min；
结果分析
① 阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，样品阳性对照为阳性，实验成功；
② 若2支样品管都为阳性，样品不符合要求；若 2 支样品管均为阴性，样品符合要求；若分别为阴阳性，则需重新进行内毒素检测，复试时做 4 支试剂管有一支为阳性则样品不符合规定。
内毒素检测的注意事项：
鲎试剂是一种生物试剂，建议进行内毒素检测时进行复核；
内毒素检测时稀释所用的仪器不能交叉反复使用；
严格控制内毒素检测时的反应温度和时间；
鲎试剂应该在低温下保存，虽然在温热的条件下鲎试剂还是相对比较稳定的，但是需要避免长时间的置于在高于 25℃的温度条件下。在内毒素检测时用的鲎试剂一般只能冻融一次，复溶的鲎试剂需存放在 2-8℃ 的冰箱内或 -20℃ 以下保存。
