婴儿若缺乏生物素会造成严重的神经症状，出现躁狂、嗜睡和发育迟缓，也因此成为婴幼儿配方食品必检项目。
到目前为止美国AOAC以及我国国标GB5009.259-2016《食品安全国家标准 食品中生物素的测定》都将微生物法作为生物素检测的首选方法和仲裁方法。
但问题来了，说起国标微生物法维生素检测，做过的人都摇头，那叫一个难做和苦逼。
难在哪呢？
前处理复杂，操作步骤繁琐，光标准曲线管就30根，一个样品就24根管，还要一根一根的在分光光度计上读数。如果稀释梯度不对，对不起，重来，简直泪奔。
那么如何做好微生物法生物素国标呢？这就是小编今天要讲的重点。其实主要把以下几点掌握好了，国标法那都不是事儿。
1、玻璃器皿处理理
虽然国标GB5009.259-2016中没有提及试管等器皿的处理，但是在国标GB5009.210-2016 《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》及GB5009.89-2016 《食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定》中都有特别注明玻璃器皿的处理，可见玻璃器皿中残留的物质对实验结果的影响不小。
其实微生物法很灵敏，所有实验接触的玻璃器皿如果残留了维生素，都会对实验造成一定的影响，所以使用前要彻底洗刷干净。
建议所有玻璃器皿先用清水浸泡半小时后，用去污粉洗刷，流水冲洗3遍以上，再用去离子水润洗3遍以上，沥干后放入烘箱170 ℃干热3 h后使用。
此外，生物素检测实验所有用品都要实验专用，不与其他实验混合使用。
2、菌株制备备
试验前一天下午把活化好的菌株转种至已灭菌的乳酸杆菌肉汤中，第二天早上要密切注意菌株的生长情况，肉汤浑浊但尚未出现沉底的情况即可取出培养箱备用。
3、试样制备新
样品处理时降温过程要迅速,避免颜色生成。样品稀释后的生物素浓度（一般可通过样品标签标示值获得）应尽量被标准溶液的系列梯度所覆盖，必要时多选几个稀释度。
4、标准系列管配置置
配制标准系列管时，用来装水、装培养基和标液的瓶子以及相应的移液管都应专用，避免生物素交叉污染。
配置标准系列管时，建议按照：添加水——添加培养基——盖上空白管的试管帽——添加标液和样品稀释液的操作顺序。
5、培养养
配置完后所有试管应放入灭菌锅内，105 ℃灭菌5 min后取出迅速冷却，避免颜色生成。
向每支测试管接种调好浊度的菌悬液，标准中规定是接种一滴。试验证明一滴的菌悬液其实大小不一，很难保证向每支测定管中加入的菌量保持一致。所以建议前面配置标准系列管时除了空白管加入5 mL测试培养基外，其余试管都加入4 mL培养基。灭菌后，将菌悬液加到剩余测试培养基中，混合（按50 μL：1mL）后再向每根测试管加入1 mL混合菌液的培养基，这样更能保证加入相对等量菌量。
6、测定定
所有试管培养16 h后，要注意观察菌生长情况，在空白接种管菌株生长的透光率不小于90%的情况下，直至标准系列管获得最大浑浊度。
7、结果分析彩
微生物的生长与待测试样中生物素含量呈线性关系，所以标准规定以标准系列管生物素含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，根据透光率与标准曲线进行比较，计算试样中生物素的含量。实验证明微生物的生长过程中还会受到竞争与抑制作用,随着生物素浓度的增加吸光度增长趋缓。标准曲线各个点并不是严格分布直线上，因此通常情况下我们能达到的标准曲线相关系数大于0.95就可以接受。
小结
终上所述，GB5009.259-2016方法其实并不难，关键还是在于细节要做好，操作人员需要积累一定的经验。考虑到这些情况，标准中也规定可采用预先包埋了菌种的微生物法生物素试剂盒测定，效果差不多。试剂盒法在相同原理下对方法进行了改进，更加简便，下期我们再对试剂盒法做一个详细介绍。
