来自河南工业大学粮油食品学院的张倩、陈复生*系统地对比了两种方法（反胶束法和碱溶酸沉法）分别提取的大豆分离蛋白样品在结构和热力学、流变学特性上的差异，分析反胶束提取对大豆分离蛋白结构和特性的影响。
1、SDS-PAGE结果分析
两种方法分离的大豆蛋白的条带对应的分子质量和标准蛋白吻合，因此可以确定两种方法得到的蛋白样品是大豆分离蛋白。对比两种方法可以看出，碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白的α亚基有部分的解离现象，条带减弱，分解成分子质量较小的条带。这说明反胶束法相较于传统方法而言更能保持蛋白分子的生物活性。
2、傅里叶变换红外光谱定量分析蛋白的二级结构
酰胺I带的波数范围为1600～1700 cm-1，是由肽链上的羰基（C＝O）结构中双键的伸缩振动引起的，该振动能在一定程度上表征蛋白质的结构特征。因此对蛋白质二级结构的表征重点分析该酰胺I带的谱图。反胶束法和碱溶酸沉法分离得到的样品的酰胺I 带对应的波数分别为（1653.0±2.9）cm-1和（1653.0±1.1）cm-1，没有明显差异。反胶束法得到的大豆分离蛋白的β-折叠含量明显低于碱溶酸沉法，但β-转角结构含量有所增加，这很有可能是两种结构之间发生相互转化。β-折叠相较于α-螺旋结构而言是一种舒展的结构，是通过众多链间氢键相连接的稳定的片层结构，而β-转角则是肽链伸展方向产生180°转变处的分子结构。因此，反胶束法得到的大豆蛋白β-折叠含量的降低和β-转角结构含量的增加将直接导致蛋白分子稳定有序链层结构减少，整个分子的紧实性降低，分子所占空间增加。而碱溶酸沉法得到的大豆蛋白的β-折叠含量较高，说明蛋白分子的展开程度更高。二级结构的差异一方面表明不同的提取方法会对蛋白质的结构产生影响；另一方面，结构的差异也会影响蛋白产品的相关性质，如溶解性、热稳定性、表面疏水性、成胶性等。
3、蛋白质表面疏水性和二硫键含量的变化
碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白对应的表面疏水性明显高于反胶束法。表面疏水性的变化是蛋白质在提取过程中分子结构展开的程度不同导致的。碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白的分子结构展开更明显，更多的内部疏水基团暴露出来；而反胶束方法能够最大程度上保持蛋白质的分子链折叠结构，这也再次从结构上证实反胶束体系独特的“水核结构”能够保持蛋白质的生物活性。反胶束法分离得到的大豆蛋白的二硫键含量低于碱溶酸沉法。宏观上看是由于不同方法得到的大豆分离蛋白的7S和11S亚基的含量不同，导致蛋白质分子中的二硫键含量也存在差异；从分子结构上看主要是由于反胶束环境会对蛋白质表面的巯基和二硫键产生作用，破坏二硫键的形成。
4、蛋白质分子粒径的变化
反胶束法得到的大豆分离蛋白的平均粒径要大于传统碱溶酸沉法。且两种蛋白的粒径分布范围都比较宽，多分散系数都在0.5左右，因此，参考平均粒径的结果，重点通过粒径分布图来分析两者粒径之间的差异。基于体积分数的粒径分布可以明显看出，反胶束法得到的蛋白质样品的粒径分布有两个窄峰，而碱溶酸沉法得到的蛋白溶液只有一个宽峰，位置在反胶束法样品的两个峰中间。表明碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白溶液中分子间聚集现象整体比反胶束方法明显。这和表面疏水性的结果是一致的。
5、蛋白质的热稳定性
两种方法得到的大豆分离蛋白都有两个吸热峰，这主要是由于大豆分离蛋白有7S和11S两种亚基。反胶束法对应的变性峰值分别为（70.03±0.56）℃和（98.85±0.67）℃；传统碱溶酸沉法对应的变性峰值分别为（75.12±0.84）℃和（97.37±0.16）℃。因此，在70～75 ℃时蛋白已经开始变性，这很有可能是部分7S亚基发生变性导致的，且反胶束法对应的变性峰温度较低，说明反胶束法得到的7S亚基热稳定性较差；而97～98 ℃时的变性峰则为11S亚基发生变性导致的。反胶束法得到的大豆分离蛋白吸热峰的焓变为（6.06±0.58）J/g和（0.31±0.02）J/g；碱溶酸沉法对应的焓变为（8.47±0.60）J/g和（0.84±0.34）J/g。两种方法焓变的差异和前述结构方面的变化一致，即碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白结构上已经部分展开，发生变性聚集时所需要的能量更高。反胶束法得到的大豆分离蛋白的玻璃态转变温度有两个，分别是（47.76±1.62）℃和（69.38±0.62）℃；而碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白只出现了一个较为明显的玻璃态转变温度（（58.81±1.42）℃）。反胶束法得到的大豆分离蛋白的两个玻璃态转变温度分别对应的依然是7S和11S亚基；而碱溶酸沉法分离得到的大豆分离蛋白只出现了一个玻璃态转变温度，有可能是两种成分玻璃态转变出现叠加的结果。反胶束法得到的蛋白质的玻璃态转变温度略低于碱溶酸沉法。
6、蛋白质的凝胶特性
从整体趋势上可以看出两种蛋白在加热过程中G’和G”同时上升，且G’高于G”，因此可以确定凝胶体系的形成。由于两种样品均在相同的条件下加热，因此G’开始激增的时间先后可以作为成胶能力的衡量标准。碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白开始形成凝胶的温度点为95.00 ℃，而反胶束法对应的大豆分离蛋白开始形成凝胶的温度点为78.44 ℃，可以明显看出反胶束法相较于传统碱溶酸沉法而言更易形成凝胶。G’和G”在极短的时间内就大幅度上升；而反胶束法得到的大豆分离蛋白的G’和G”却整体呈现缓慢的上升趋势，慢慢形成凝胶网络结构，即反胶束法得到的大豆分离蛋白凝胶形成的速度较慢。碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白对应的G’为1108.96 Pa；反胶束法得到的大豆分离蛋白对应的G’为122.70 Pa。因此，碱溶酸沉法得到的大豆分离蛋白形成的凝胶强度远优于反胶束法。两种样品的G’和G”是相互平行的，且G’＞G”，即形成了典型的凝胶结构。碱溶酸沉法得到的蛋白凝胶的频率扫描曲线斜率较大，即蛋白质在形成凝胶时分子交联现象更多。
结 论
反胶束法得到的大豆分离蛋白的β-折叠结构含量较低，β-转角结构含量较高，蛋白展开程度较低，具有较低的表面疏水性，相较于传统碱溶酸沉法能够较好地保持蛋白质的天然分子结构；反胶束法得到的蛋白质的热稳定性较差，更易于形成凝胶，但所形成的凝胶强度较低。结论：反胶束萃取环境独特的水核结构能够较好地保持大豆分离蛋白的天然分子结构。
