活性氧（ROS）所造成的氧化损伤会导致衰老、动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等的发生发展。来自华南理工大学食品科学与工程学院的林恋竹、朱启源和赵谋明*采用酶法制备辣木籽水解物，以抗氧化活性为跟踪指标，通过乙醇分级沉淀和大孔树脂柱层析法定向制备辣木籽抗氧化肽，构建模拟胃、肠道消化模型，评价辣木籽抗氧化肽胃、肠道消化物的氧自由基吸收能力（ORAC），解析消化物中多肽组成与结构，研究经胃、肠道消化后的辣木籽抗氧化肽对氧化损伤红细胞溶血的抑制作用，基于生物可接受度评价辣木籽肽的抗氧化活性。
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辣木籽抗氧化肽的制备
1.1 辣木籽水解物的酶法制备与乙醇分级沉淀纯化
各乙醇分级沉淀组分的抗氧化活性均高于辣木籽水解物，说明辣木籽水解物中各组分存在拮抗作用，影响了其抗氧化活性的发挥。乙醇分级沉淀法可将各组分有效分离，提升辣木籽水解物的抗氧化活性。其中，60%醇沉组分蛋白质量分数最高，且抗氧化活性较高，因此选取该组分进行下一步分离纯化。
1.2 大孔树脂柱层析法分离纯化
所得4 个洗脱组分抗氧化活性存在显着差异，以60%乙醇洗脱组分蛋白质量分数最高（92.84%），抗氧化活性最强（DPPH自由基清除能力和ORAC分别为39.95、1454.57 μmol/g，分别是辣木籽水解物的17.0 倍和8.5 倍）。说明XAD-16树脂柱层析法可对60%醇沉组分中抗氧化肽进行有效分离，得到60%乙醇洗脱组分（下称辣木籽抗氧化肽）。
1.3 氨基酸组成分析
辣木籽水解物中，酸性氨基酸和疏水性氨基酸的质量分数较高（共占总氨基酸的59.80%）。辣木籽抗氧化肽富含抗氧化氨基酸、疏水氨基酸（共占总氨基酸的54.37%），具有更强的抗氧化活性，说明这两类氨基酸对辣木籽肽的抗氧化活性有重要贡献。
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基于生物可接受度评价辣木籽肽的抗氧化活性
2.1 模拟胃、肠道消化对辣木籽抗氧化肽ORAC的影响
辣木籽抗氧化肽经过胃、肠道消化后ORAC呈现上升趋势。说明胃、肠道酶系可进一步水解辣木籽抗氧化肽，生成抗氧化活性更强的片段。
2.2 UPLC-QTOF-MS/MS解析消化物中多肽组成与结构
从辣木籽抗氧化肽消化物中共鉴定出11 条二肽和5 条三肽。其中含有抗氧化氨基酸的肽有5 条（Gln-His（QH）、Cys-Pro（CP）、Gln-Met（QM）、Gln-Arg（QR）、Gln-Met-Phe（QMF）），含有疏水性氨基酸的肽有9 条（Pro-Arg（PR）、Ala-Arg（AR）、Gly-Leu(Ile)（GL(I)）、Val-Glu（VE）、Leu(Ile)-Gln（L(I)Q）、Leu(Ile)-Phe（L(I)F）、Val-Leu(Ile)（VL(I)）、Ala-Leu(Ile)-Pro（AL(I)P）、Pro-Leu(Ile)-Gln（PL(I)Q）），既含有抗氧化氨基酸又含有疏水性氨基酸的肽有2 条（Ser-Ala-Cys（SAC）、Trp-Val-His（WVH））。
2.3 辣木籽抗氧化肽胃、肠道消化物对氧化损伤红细胞的保护作用
经AAPH损伤后，红细胞发生溶血，溶血率为48.85%，与正常组（5.28%）相比具有显着性差异（P＜0.05）。辣木籽抗氧化肽胃、肠道消化物、Gln-Met、Leu-Phe和GSH可显着抑制AAPH损伤红细胞发生溶血，且随多肽质量浓度增加溶血率显着降低，4 种多肽对氧化损伤红细胞的保护作用从强到弱依次是Gln-Met＝GSH＞辣木籽抗氧化肽＞Leu-Phe。
AAPH诱导产生的ROS可引起细胞中脂质过氧化，上调MDA含量。红细胞经AAPH损伤后，MDA含量为5.71 nmol/mg，是正常组（2.47 nmol/mg）的2.31 倍。4 种多肽可显着下调氧化损伤红细胞中MDA含量，且随多肽质量浓度增加胞内MDA含量显着下降，说明4 种多肽可有效清除ROS，下调MDA含量。其中，Gln-Met在低、中、高3 个剂量下均可显着降低胞内MDA含量至正常组水平。
模型组SOD活力显着高于正常组，说明ROS的过量产生激活了细胞中酶抗氧化防御系统，使得SOD活力升高。4 种多肽可在一定程度上下调SOD活力，说明这4 种多肽均能有效降低细胞内ROS水平。少量ROS不足以激活酶抗氧化防御系统，因此，减少细胞中酶抗氧化防御系统对AAPH所致氧化应激的应答可使SOD活力下降。
结 论
采用20%（体积分数，下同）、40%乙醇分级沉淀辣木籽水解物去除杂质，取60%乙醇分级沉淀组分进行柱层析分离纯化，经水、20%乙醇、40%乙醇洗脱除杂，采用60%乙醇洗脱，定向制备得到富含抗氧化氨基酸、疏水性氨基酸的辣木籽抗氧化肽（蛋白质量分数92.84%，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力、ORAC分别为39.95、1454.57 μmol/g）；辣木籽抗氧化肽经模拟胃、肠道消化后，抗氧化活性增强，释放出更多短肽段，包括11 条二肽、5 条三肽；辣木籽抗氧化肽消化物、Gln-Met、Leu-Phe通过清除胞内活性氧，下调丙二醛含量与超氧化物歧化酶活力，拮抗AAPH所致氧化应激，有效抑制氧化损伤红细胞发生溶血。
