东北农业大学食品学院的刘英杰、隋晓楠、黄 国、江连洲*等人研究发现，SPI与花青素可以形成非共价键及共价键，并就两者在碱性条件下发生的共价交联作用对蛋白结构及界面蛋白性质的影响进行剖析。由此，为更加明确地了解SPI与花青素共价交联对蛋白结构的影响，本实验选用两种常见的共价交联机制——生物酶法和化学碱法对不同质量浓度花青素与SPI进行共价处理，并就两种共价交联方式对SPI结构产生的影响进行比较，同时探究添加不同质量浓度花青素后对SPI结构的改变。旨在为SPI与花青素共价交联作用的研究提供重要指导意义，这些研究的积极成果将使人们更加直观及深入地了解生物酶法与化学碱法对蛋白结构产生的影响，为SPI在食品中的合理应用提供理论支持。
1、共价结合率分析
在同一共价交联方式下，共价交联花青素含量随花青素质量浓度升高而升高，这主要是因为同一共价处理条件下，不同质量浓度花青素与SPI的共价结合率几乎相同（生物酶法：97.0%～98.0%；化学碱法：93.0%～95.5%），所以共价聚合物中花青素的质量浓度越高，共价交联花青素含量越高。而且，表明LC1共价交联花青素含量高于AC1 3.87%，LC2高于AC2 2.58%，LC3高于AC3 4.43%。上述结果表明在漆酶氧化条件下，花青素与SPI可以发生更强的共价相互作用。
2、游离巯基含量分析
使用生物酶法与化学碱法共价交联花青素与SPI后，明显降低了SPI的游离巯基含量（P＜0.05）。同时，随着花青素质量浓度升高，所有样品的游离巯基基团含量呈现持续降低趋势。尤其是在多酚氧化酶（漆酶）存在的条件下，当花青素质量浓度为0.5 g/L时，相比较于天然SPI，样品的游离巯基含量降低了66.73%，并且其降低程度明显高于同质量浓度花青素在碱性条件下对SPI游离巯基含量的影响（P＜0.05）。
3、傅里叶变换红外光谱分析
不同质量浓度花青素的添加都降低了SPI酰胺I带的吸光度，并且致使SPI酰胺I带的红外吸收峰发生不同程度的蓝移，这表明不同质量浓度花青素对SPI的共价交联作用不同程度地改变了蛋白质的二级结构。当花青素质量浓度为0.5 g/L时，将生物酶法和化学碱法两种共价交联方式下的花青素-SPI共价聚合物与天然SPI的傅里叶红外光谱图进行比较。
4、紫外-可见光谱分析
花青素的添加使SPI的紫外-可见吸收光谱峰值升高，且在同一种共价交联方式条件下，SPI的吸收光谱峰值随花青素的质量浓度升高而增加。但在同一质量浓度花青素条件下，生物酶法交联的花青素-SPI共价聚合物比化学碱法交联的聚合物峰值高。值得注意的是，花青素的添加不仅改变了SPI吸收光谱的峰值，而且使得SPI的紫外吸收光谱在290 nm波长处的峰位发生了蓝移，尤其在花青素质量浓度为0.5 g/L，生物酶法交联的聚合物峰位蓝移最为明显，由波长290 nm蓝移至287 nm。
5、荧光光谱分析
花青素与SPI的共价交联使得SPI的荧光强度发生了猝灭现象，并且花青素质量浓度越高，SPI的荧光强度猝灭现象越明显。同一花青素质量浓度，生物酶法条件下花青素对SPI荧光强度的猝灭程度高于化学碱法条件。这说明生物酶法条件下和化学碱法条件下花青素与SPI发生了相互作用，可能是因为花青素氧化形成的醌类物质上的C与SPI芳香族氨基酸的自由氨基（—NH2）的N发生亲核反应形成C—N键，从而导致蛋白发色基团的减少，使得SPI的荧光强度下降，并且两者在生物酶法条件下的相互作用强于在化学碱法条件下的反应。
结 论
本实验采用生物酶法和化学碱法共价交联花青素与SPI，运用不同的色谱和光谱手段探究两种共价交联方式对SPI结构的影响。研究得出以下结论：1）加入同质量浓度花青素，相较于化学碱法来说，生物酶法共价处理使花青素与SPI的结合率更高。2）花青素对SPI的共价交联降低了蛋白质中的游离巯基含量，且花青素质量浓度越高，样品中游离巯基含量越少；生物酶法交联的花青素-SPI共价聚合物比化学碱法交联的聚合物巯基含量少。3）傅里叶变换红外光谱表明共价交联处理下，随着花青素质量浓度升高，蛋白α-螺旋和β-折叠含量逐渐降低，β-转角和无规卷曲含量逐渐升高，花青素进而诱导蛋白质解折叠，而生物酶法处理的样品中蛋白质二级结构含量的改变比化学碱法更明显。4）紫外-可见吸收光谱和荧光光谱表明花青素对SPI的共价交联使得SPI的紫外吸收值升高，荧光强度下降、最大吸收波长发生改变，而上述趋势，生物酶法交联的花青素-SPI共价聚合物展现的更为显着，这表明花青素可以改变SPI芳香族氨基酸残基的微环境，使SPI多肽链解折叠，进而使其三级结构构象发生改变，而同质量浓度花青素下，生物酶法较化学碱法使得花青素与SPI共价相互作用更强，花青素能更大程度地改变蛋白质的三级结构。
