来自上海海洋大学食品学院的张皖君、蓝蔚青*、段贤源和谢晶*等人在进行挥发性盐基氮（TVB-N）含量、K值等品质指标测定的基础上，通过Illumina Miseq测序平台和PICRUSt功能预测工具来对比分析不同冰藏条件下鲈鱼菌群结构和代谢功能的差异，以揭示鲈鱼冰藏过程中的微生物变化规律及致腐机制，为后期靶向抑制其腐败变质提供理论依据。
1、TVB-N含量和K值分析
从6 d开始，CI组样品的TVB-N含量明显上升，在12 d时超过一级鲜度的极限值，贮藏18 d时已接近限量标准。SI组样品的TVB-N含量在18 d时处于一级鲜度，AEWI组样品也处于新鲜状态，贮藏后期SI组样品的TVB-N含量在初始值附近，明显低于AEWI组样品。一般认为作为生鱼片的新鲜鱼K值约在20%以下，20%～50%为二级鲜度，大于70%为不可食用。鲈鱼样品的初始K值为（3.95±0.18）%，表明样品的新鲜度较高。在贮藏第21天，CI和AEWI处理组样品的K值分别达到（76.41±2.12）%、（75.95±2.01）%，SI组样品为（51.08±1.22）%，低于其余两组。因此，SI可抑制样品蛋白质和核苷酸的降解速度，其中AEWI组的保鲜效果优于CI组。
2、样品细菌多样性分析
经质控与过滤等处理后得到了鲈鱼样品的有效序列，不同贮藏时间下每组样品的有效序列数均在10000以上，有效序列达50%以上，表明测序所得到的有效序列可达到后续微生物多样性分析的要求。对97%相似水平下的OTU进行生物信息统计，AEWI和CI组样品随着贮藏时间的延长，OTU数量明显增加，SI组鲈鱼样品OTU数量在贮藏后期较少，表明菌群种类较少。各样品的测序深度指数Coverage值均大于0.99，说明样品中序列未被测出的概率较低，测序结果可反映不同冰藏过程中鲈鱼样品的真实情况。AEWI组中Chao1、Ace、香农指数最小的均为样品A2，数值最大的均是样品C2，这说明AEWI组中的鲈鱼样品在3 d时物种丰富度最低，在21 d时物种丰富度和微生物多样性达到最高，可能由于此时AEWI中的有效氯成分挥发，抑菌效果降低，导致微生物污染和繁殖加剧。CI组在贮藏12 d物种丰富度和微生物多样性较高，说明微生物种类和含量迅速增加，鲈鱼样品在此时已腐败。SI组中A1样品的物种丰富度最高，可能由于贮藏前期SI中的微生物与鱼体发生交叉感染，导致微生物数量增加。SI组样品中，C1的Ace、Chao1和香农指数最低，辛普森指数最高，表明SI贮藏末期样品菌群丰度及多样性较低，其原因可能是“微冻”温度抑制了部分微生物的生长与繁殖，使鲈鱼样品菌群结构发生较大变化。随着测序量的增加，各组样品稀释性曲线逐渐进入饱和期，说明测序量合理充分，测序深度已基本覆盖所有物种信息。同时，香农指数曲线也趋于平缓，表明测序数据可反映样品中微生物菌群多样性组成，更多数据量对发现新的OTU贡献很小。
3、不同冰处理对鲈鱼贮藏过程中细菌群落结构的影响
鲈鱼在不同贮藏阶段中的菌群结构差异较大。在冰藏初期（3 d），3 组中鲈鱼样品A1、A2、A3主要以芽孢杆菌属（Bacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、肾杆菌属（Renibacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）为主，其中在菌群中占比例最大的是芽孢杆菌属，分别达30.08%、38.12%、33.82%。随着冰藏时间的延长，鲈鱼样品中芽孢杆菌属、乳球菌属和大洋芽孢杆菌属相对丰度明显下降，且以上菌属在AEWI组和CI组的相对丰度显着高于SI组。随着贮藏时间的延长，SI处理样品中的假单胞菌属（Pseudomonas）、希瓦氏菌属（Shewanella）相对丰度分别由1.25%、0.03%升至4.38%、4.06%，摩替亚氏菌属（Moritella）、埃希氏杆菌属（Escherichia）和别弧菌属（Aliivibrio）在贮藏中、后期所占比例逐渐增大，优势明显。在AEWI和CI组样品中，假单胞菌属、短波单胞菌属（Brevundimonas）与不动杆菌属（Acinetobacter）在贮藏前期均未检出或检出量很少，到12 d时，其所占比例总体呈增长态势，21 d时AEWI组假单胞菌属和不动杆菌属迅速增加，加速了冰鲜鲈鱼的腐败。CI组在21 d时不动杆菌属比例达27.77%，说明该菌是影响CI组贮藏过程中鲈鱼腐败变质的优势菌属。综上所述，假单胞菌属、不动杆菌属和希瓦氏菌属可能是鲈鱼冰藏期间的主要优势菌。
4、PCA比较分析
对于主成分PC1-2分析，冰藏前期的样品A1、A2、A3样品较为相近，说明在这一主成分水平上3 种保鲜冰处理下鲈鱼贮藏前期的菌群特征较为相近。对主成分PC1-3分析，在主成分PC3方面，贮藏21 d的3 组鲈鱼样品与前、中期样品的距离区分度明显，表明样品在冰藏末期的菌群组成发生较大变化，该结果与群落结构分析结果一致。温冬玲等在不同增菌温度下冷鲜鸡肉细菌群落的主成分分析中也得到相似结果。主成分PC2-3分析中，贮藏12 d的样品B1、B2、B3间与贮藏21 d的C1、C2、C3样品间在主成分PC2和PC3方面均距离相对较远，贮藏中期和末期样品在几种特定微生物组成上均有较大差异。总体来看，在各个主成分坐标轴上，贮藏末期3 个处理组样品与前、中期样品均相距较远，且贮藏末期的样品C2、C3与C1相互间也有一定距离，表明贮藏时间及冰藏方式对鲈鱼样品微生物种类及组成变化影响显着，导致冰鲜鲈鱼群落结构组成发生较大变化。
5、TVB-N含量、K值相关细菌筛选
在属水平上，利用皮尔森相关性检验冰藏期间鲈鱼TVB-N含量、K值与微生物群落的相关性，筛选出相对丰度＞1%，r＞0.5且P＜0.05的相关细菌。鲈鱼样品中与TVB-N含量显着相关的细菌共4 个，其中与TVB-N含量呈正相关的有假单胞菌属、短波单胞菌属和不动杆菌属。与K值显着相关的细菌有8 个，其中呈正相关的主要是嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、假单胞菌属和希瓦氏菌属，表明这些微生物可能是导致冰藏期间鲈鱼腐败变质的优势菌。
6、PICRUSt功能预测
利用软件PICRUSt进行功能基因的同源蛋白簇预测（相对丰度＞0.1%），在功能聚类上，鲈鱼样品细菌代谢相关基因能基本按不同贮藏时间聚成3 类（即前、中、后期），不同保鲜冰组之间有交叉，也有相似之处。冰藏至21 d时，鲈鱼样品中与上述新陈代谢和能源生产与转换相关的基因在数量上呈C2＞C3＞C1的趋势。其中，有关氨基酸、碳水化合物和脂质代谢的基因在数量上，C3和C2显着高于C1。表明随着贮藏时间的延长，在相关微生物作用下，CI和AEWI的样品更易进行氨基酸、脂质和碳水化合物代谢产生醛、酮和酸等物质，使鱼体产生腥臭味，品质下降。说明PICRUSt功能预测在肌肉新陈代谢相关菌的研究上表现出良好的应用前景，能为从微生物代谢角度延缓鲈鱼腐败的研究提供新思路。
结 论
SI和AEWI对鲈鱼均有一定的保鲜作用，其中SI抑制鲈鱼蛋白质和核苷酸降解速度的效果最显着。在冰藏前期（0～3 d），AEWI与CI组样品中芽孢杆菌属（Bacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）相对丰度明显高于SI组。冰藏中、后期（12～21 d），SI组样品中假单胞菌属（Pseudomonas）、希瓦氏菌属（Shewanella）、摩替亚氏菌属（Moritella）、埃希氏杆菌属（Escherichia）和别弧菌属（Aliivibrio）相对丰度明显增加，AEWI组样品假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter）相对丰度所占比例逐渐增大，CI组中不动杆菌属在21 d时达27.77%，成为造成鲈鱼贮藏中、后期腐败的主要菌属。主成分分析表明，冰藏方式及贮藏时间对鲈鱼菌群结构组成有较大影响。鲈鱼菌群中与TVB-N含量、K值呈正相关的有假单胞菌属、不动杆菌属、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和希瓦氏菌属，它们可能是鲈鱼冰藏期间的优势菌。CI和AEWI组鲈鱼细菌中参与氨基酸、脂质和碳水化合物代谢的相关基因相对丰度高于同一时期的SI组，这在一定程度上从细菌代谢水平解释了SI能延缓鲈鱼腐败的原因，为后期进一步从微生物抑制机制上优化鲈鱼贮藏保鲜技术提供了理论参考。
