北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学的扎木苏、杨华青、王成涛*等人将来源于S. cerevisiae G20的Str3基因重组转化到E. coli BL21中进行超表达，正交设计试验优化重组蛋白Str3p诱导表达条件以提高其表达量，亲和层析纯化后研究Str3p催化生成糠硫醇的能力，该方面研究将为糠硫醇生物转化、发酵食品特征风味形成提供指导。
1、Str3p异源表达工程菌构建
结果可知，目的蛋白分子质量约为52 kDa，这与酿酒酵母Str3p分子质量的理论计算值（52.7 kDa）一致。重组菌在低温条件下诱导，Str3p表达量较高，其质量浓度约为0.89 mg/mL。前人同样表达纯化酿酒酵母VIN 13的Str3p，其分子质量约为52 kDa，与本实验结果一致。
2、诱导条件对工程菌E. coli BL21（pEASY-E1-Str3）的Str3p表达量的影响
IPTG浓度对Str3p表达量的影响
IPTG浓度对Str3p酶活力变化有显着影响（P＜0.05），随其浓度的增加，Str3p酶活力呈现先增后降的趋势，其中最适IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L，当IPTG浓度过高时，可能会影响菌株生长和蛋白的表达，进而导致Str3p酶活力降低。
诱导温度对Str3p表达量的影响极显着（P＜0.01），Str3p最适诱导温度为20 ℃，随着温度的升高，酶活力逐渐下降。通常温度的升高往往会使蛋白错误折叠形成包涵体，从而失去活力，但过低的温度也会导致菌体生长受到抑制，使蛋白表达量下降。
诱导时间对Str3p表达量的影响
诱导时间对Str3p表达量有显着影响（P＜0.05），随诱导时间的延长，Str3p酶活力不断上升，当诱导时间大于13 h时，Str3p酶活力急剧下降，因此认为13 h为适宜的IPTG诱导时间。通常诱导时间短，菌体生长仍处于适应期，蛋白表达量较低，以致酶活力降低。
3、正交设计试验优化Str3p酶活力结果
3 个因素条件对Str3p表达量的影响大小依次为IPTG浓度＞诱导温度＞诱导时间，最优诱导条件为A2B2C3，即IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导温度20 ℃、诱导时间13 h。按照优化诱导条件进行3 次平行验证实验，Str3p最高表达量为1.26 mg/mL，与未优化时的表达量（0.89 mg/mL）相比，正交试验优化使得Str3p表达量提高41.7%，且在该条件下酶活力较优化前提高38.6%，明显提高Str3p的表达量及其酶活力，满足后续催化实验需求。
4、反应液挥发性成分分析
GC-MS分析发现一个保留时间为5.29 min的目标化合物，其离子流图显示特征离子为m/z 95和96，另一个化合物在保留时间为6.52 min处显示的特征离子为m/z 53、81和114，这与NIST谱库中糠醛和糠硫醇的特征离子m/z相匹配。
5、Str3p催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物
Str3p酶活力受pH值影响较大（P＜0.05），随着pH值的升高，催化效率逐渐增加，当pH 8.0时，催化效率达到最大，在底物浓度10 mmol/L、50 μg/mL的Str3p 1 h能催化产生47 μmol/L的糠硫醇。有学者发现细菌来源的C—S β裂解酶能催化合成硫醇类物质，其转化率普遍较低。
结 论
通过基因工程技术构建高效表达Str3p的工程菌E. coli BL21（pEASY-E1-Str3），正交设计试验优化其蛋白诱导条件，并以半胱氨酸-糠醛加合物为底物，验证Str3p的催化作用。研究发现在诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导温度20 ℃、诱导时间13 h时，重组Str3p质量浓度为1.26 mg/mL，蛋白表达量和酶活力较优化前分别提高41.7%和38.6%；纯化后Str3p受反应pH值条件影响较大，在pH 8.0时，能够催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物（10 mmol/L）生成47 μmol/L糠硫醇。该研究结果将为天然硫醇类香料绿色制造、发酵食品特征风味形成提供理论支持和技术指导。
