在反相色谱分析中，流动相的PH值一般在2.5－7之间，当分析物在反相条件下可离解，或样品的PH值在2.5－7之外时，就需要缓冲液，在反相条件下可离解的化合物一般有氨基和羧基，他们的Pka在1－11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团处于一种形式，离子形式或中性化合物的形式，如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和或减小其危害，
如何选择缓冲液PH值
在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个单位的值，有助于获得好的或尖的峰，从HH公式得知，溶液PH值高于或低于两个Pka两个单位，化合物99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰，
让我们通过一个离子来看如何选择PH值
例如苯甲酸，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上讲当PH值等于2.2时，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，磷酸和柠檬酸缓冲液能用于PH等于2.2。
当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低时均适合应用，你也许会问水的PH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲液有助于增加方法的可靠性，以及的尖锐性，PH值降低有助于氨基化合物保留时间减小，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，磷酸钾盐适合用于氨基化合物。
在一般情况下，他是含羧基，氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基分析中钾盐比钠盐更好。
为离子对试剂选择缓冲液
为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的，离子对试剂例如四丁基铵，十四烷基磺酸钠，在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对，在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。
应用缓冲液PH值来调节选择性
当氨基保留造势，氨基的保留随PH的减少而降低，这个特性可以用来调节选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，改变PH值可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠PH值，所以变化PH值可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果PH值变小，出峰便快，化合物中可能存在氨基，当PH变大,化合物出峰很快，或处在死时间处，化合物可能存在的羧基离子。
