来自江苏省农业科学院农产品加工研究所的吴海虹、孙芝兰*、张新笑和徐为民等人以青虾为对象，通过16S rDNAV4区域扩增子测序分析，研究冷藏（4.0±0.5）℃条件下气调包装和空气包装方式对微生物菌群多样性的影响，确定导致青虾腐败的优势菌，为探索延长青虾货架期的保鲜工艺提供理论依据。
1、不同包装方式对青虾贮藏过程中菌落总数的影响
在两种不同的包装方式中，随着贮藏时间的延长，菌落总数均逐渐增加。样品初始菌落总数为5.59（lg（CFU/g）），托盘包装组的菌落总数增长迅速，贮藏的第2天菌落总数已达6.27（lg（CFU/g）），而气调包装组菌落总数增长缓慢；在贮藏的第6天菌落总数为5.99（lg（CFU/g）），与托盘包装组第1天时接近。在整个贮藏过程中，气调包装组样品的菌落总数均显着低于托盘包装组（P＜0.05），说明CO2气调包装方式能有效延长青虾的货架期。
2、不同包装方式对青虾贮藏过程中TVB-N含量的影响
随着贮藏时间的延长，两种不同包装方式的青虾TVB-N含量均逐渐增加。在托盘包装组青虾在贮藏的前2 d，TVB-N含量由最初的12.7 mg/100 g增长至20.4 mg/100 g，而气调包装组青虾在贮藏的第4天，TVB-N含量为21.3 mg/100 g。因此托盘包装组和气调包装组的青虾分别于贮藏的第2天和第4天到达腐败节点，后续微生物菌群分析样品分别取自托盘包装的第2天和气调包装的第4天。
3、基于16S rRNA基因测序的物种多样性
取初始样品、托盘包装组和气调包装组进入腐败期的样品，进行16S rRNA V4区测序。3 组样品产生的有效片段数量在65219～95052 之间，平均长度在250～257 bp之间，98.5%的碱基Q值大于20（即错误率小于1%）。在有效的片段数量中，初始样品、托盘包装组和气调包装组的GC含量分别为50.2%、51.2%和52.0%。对样品中有效的Tags进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，然后对OTUs的代表序列进行物种注释，发现这3 组样品中的菌群主要包含变形菌门（Proteobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、绿弯菌门（Chloroflexi）、互养菌门（Synergistetes）10 个优势菌门。
4、物种相对丰度分析
初始样品、托盘包装组和气调包装组样品所含微生物种类和数量在科、属和种水平均有差异。初始样品中支原体科Mycoplasmataceae所占比例最大，为42.4%，其次为莫拉菌科Moraxellaceae，所占比例为34.6%，黄杆菌科Flavobacteriaceae占3.5%；托盘包装组中在科水平下主要有Moraxellaceae（25.0%）、Flavobacteriaceae（18.4%）、希瓦氏菌科Shewanellaceae（12.2%）、假单胞菌科Pseudomonadaceae（5.5%）、普雷沃氏菌科Prevotellaceae（6.0%）和毛螺菌科Lachnospiraceae（3.7 % ） ；气调包装组的菌群在科水平下主要有Pseudomonadaceae（26.4%）、Moraxellaceae（14.6%） 、鞘脂单胞菌科Sphingomonadaceae（7.6%）、Lachnospiraceae（3.8%）和疣微菌科Ruminococcaceae（3.3%）。从科水平来看，与初始样品相比，托盘包装组第2天科水平的丰富度增加，Flavobacterium、Shewanellaceae、假单胞菌科等一些嗜冷菌相对丰度增加。而与托盘包装组相比，气调包装组假单胞菌科逐渐占据优势，这可能是因为Flavobacterium、Shewanellaceae对低氧环境耐受能力更差，而假单胞菌科有更强的耐受力。从属水平来看，初始样品中优势菌属主要为嗜冷杆菌属Psychrobacter（33.6%）和Candidatus Bacilloplasma（42%），两者总丰度占75.6%。与初始样品相比，托盘包装组Psychrobacter和CandidatusBacilloplasma的相对丰度大大减小，而假单胞菌属（Pseudomonas）（5.5%）、Acinetobacter（13.9%）、Flavobacterium（12.3%）和希瓦氏菌属（Shewanella）（12.2%）相对丰度显着增加，聚类在其他的菌属由19%增加至33.7%，也说明菌种的丰富度增加。与托盘包装组相比，气调包装组假单胞菌属（26.4%）丰度显着增加，而Flavobacterium和Shewanellaceae相对丰度显着降低。聚类在其他的菌属已接近50%，气调包装使菌种的丰富度进一步增加。从种水平来看，初始样品中优势菌种主要为嗜冷杆菌属，分别为Psychrobacter arenosus（19.1%）、Psychrobacter cryohalolentis（4.3%）和Psychrobacter maritimus（1.5%）。与初始样品相比，托盘包装组Psychrobacter相对丰度降低，Shewanellaputrefaciens（11.8%）和Flavobacterium succinicans（8.0%）相对丰度显着增加；气调包装组中优势菌种主要为Pseudomonas veronii（26%）。说明气调包装抑制多数微生物的增殖，包括嗜冷菌和非嗜冷菌，但对假单胞菌的抑制效果不明显，使其逐渐生长为优势菌。
5、物种丰度聚类分析
3 组样品物种聚集差异较大。在初始样品组中，Psychrobacter、Candidatus Bacilloplasma和Planctomyces聚集较多，其他物种较分散；而在贮藏过程中，无论托盘包装还是气调包装，均有物种出现了不同程度的聚集，但集中在不同的区间。在托盘包装组中，Aeromonas、Flavobacterium、Shewanella等聚集较多，这可能与这些菌能耐受较低的温度有关。气调包装组中Pseudomonas聚集较多，说明气调包装能抑制贮藏期中优势腐败菌如Flavobacterium和Shewanella的生长，但假单胞菌属有较强的耐受力，从而逐渐生长为优势菌株。
6、Ternary plot分析
从科水平看，莫拉菌科Moraxellaceae在初始包装组和托盘包装组中有较大比例的富集，而在气调包装组中相对丰度较低，说明气调包装能抑制莫拉菌科的菌种生长。支原体科（Mycoplasmataceae）在初始样品中所占比例最大，但托盘包装组和气调包装组中比例接近都非常低，说明Mycoplasmataceae不能适应低温环境，在低温贮藏时将不会成为致腐的优势菌株。Flavobacteriaceae和Shewanellaceae在初始样品中比例较少，在托盘包装组中所占的比例大大增加，说明二者能耐受较低的温度，将会成为青虾低温贮藏时的主要威胁菌株。而在气调包装组中，二者的比例又大大降低，说明气调包装能显着抑制二者的生长，这可能与它们的多数菌株不能耐受低氧环境有关。Pseudomonadaceae在初始样品组和托盘包装组中都未有较大比例的富集，但是在气调包装组中所占比例大大增加，说明气调包装不能有效控制Pseudomonadaceae菌株的生长，需要配合一些其他的杀菌技术（例如高压静电保鲜技术）才能进一步延长货架期。从属水平看，3 组样品中的优势物种也差异较大，在初始样品组中，与物种丰度分析结果一致，优势物种为Psychrobacter和Candidatus Bacilloplasma，且相对丰度最高。在托盘包装组中，Flavobacterium、Shewanella和Arthrobacter为优势物种，但相对丰度相比初始样品组已大大降低。在托盘包装组中优势物种主要为Pseudomonas和Sphingomonas，且Pseudomonas的相对丰度远远大于Sphingomonas。另外，Acinetobacter在托盘包装组和气调包装组中都有一定程度的聚集。从种水平看，初始样品中优势菌种主要为Psychrobacter arenosus，且相对丰度较高。托盘包装组中主要为Shewanella putrefaciens和Flavobacteriumsuccinicans，同样地，二者的相对丰度相对初始样品组也大大降低。而在气调包装组中Pseudomonas veronii已占据了绝对优势，其相对丰度远远大于其他物种。
7、属水平物种进化树
初始样品组中优势物种Psychrobacter和Candidatus Bacilloplasma主要集中在两个不同的分支。在托盘包装组中，虽然物种种类丰富度增加，但种与种之间的亲缘关系较接近，依旧主要集中在两个不同的分支。但在气调包装组中，物种的丰度大大降低，丰富度却增加，散落在各个分支中。说明气调包装抑制了优势腐败菌的增长，从而使物种的丰富度增加。
8、物种多样性曲线
从物种的丰富度和均匀度来说都是初始样品组＜托盘包装组＜气调包装组，这与上述分析也较为一致，青虾经过一定的贮藏期后，物种丰富度增加，物种分布较初始样品均匀，而气调包装能抑制原本优势腐败菌的生长，造成物种的丰富度和均匀度进一步增加。
9、基于OTU的Venn分析
基于样品总OTU数作Venn图，进行相似性分析。初始样品组与托盘包装组共有的OTU数735 个，占二者OTU总数的42.4%。初始样品组中特有的OTU为102 个，托盘包装组中特有的OTU为557 个，同样也说明托盘包装组中菌群结构丰富度和均匀度与初始样品相比有所增加。气调包装组与托盘包装组共有的OTU为851 个，占二者总数的35.8%，气调包装组中特有的OTU为744 个，说明气调包装组中菌群结构的丰富度和均匀度稍高于托盘包装组，但二者的菌群结构差异较大。
10、物种主坐标PCoA分析
初始样品组、托盘包装组和气调包装组3 组样品分别聚集在不同的象限，说明这3 组样品微生物群落结构存在显着差异。初始样品组的聚集性明显高于托盘包装组和气调包装组，说明初始样品组样品个体之间重复性高于另外两组，即初始样品组样品中所含有的微生物群落多样性较小。而托盘包装方式下微生物群落多样性增加，说明原始的优势菌株不能耐受较低的贮藏温度，而原本非优势的耐低温菌株快速生长，造成比例增大。托盘包装优势菌株聚集在第四象限而气调包装组聚集在第三象限，说明气调包装能抑制优势腐败菌-耐低温菌株的生长，起到较好的保鲜作用。
结 论
托盘包装组和气调包装组的货架期分别为2 d和4 d；且两种包装方式下变质青虾的菌群结构有较大差异，在托盘包装方式下，优势菌群主要以不动杆菌、黄杆菌和希瓦氏菌为主，是普通低温贮藏时造成青虾腐败的主要菌群；采用气调包装后，黄杆菌和希瓦氏菌数量大大降低，假单胞菌成为主要优势菌群；体积分数50%CO2＋50%N2气调包装能抑制托盘包装时优势腐败菌的增殖，从而延长货架期；而假单胞菌有较强的耐受力，成为新的优势腐败菌。研究结果为保障青虾的质量安全提供了理论依据。
