来自华南理工大学食品科学与工程学院的赵谋明、邹 颖、林恋竹*等人拟优化纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶揺瓶、发酵罐条件，制备高纳豆激酶活力、富含谷物多酚且具有强抗氧化活性的发酵产物。对比大豆分离蛋白酶解物与商业大豆蛋白胨作为补充氮源时菌体生长规律以及代谢物质（酶、可溶性蛋白、还原糖、多酚及抗氧化物质）变化规律，为工业化放大生产纳豆激酶提供理论与方法指导。
1、纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶摇瓶条件优化结果
α-淀粉酶添加量对纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶活力的影响
随着α-淀粉酶添加量的增加，纳豆激酶活力呈现先升高后下降的趋势。未添加α-淀粉酶的发酵培养基黏稠且流动性差，不利于纳豆菌利用；添加α-淀粉酶后，荞麦中淀粉被可控水解，更容易被纳豆菌利用，纳豆激酶活力从未添加α-淀粉酶时的420.12 U/mL提升到535.66 U/mL，故选择α-淀粉酶添加量为0.4%。
补充氮源对纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶活力的影响
大豆分离蛋白酶解物的水解度随酶解时间延长而增加。3 种酶水解大豆分离蛋白所得酶解物水解度从高到低依次为胰酶＞NS37071＞复合蛋白酶。不同水解度的大豆分离蛋白酶解物作为补充氮源时，纳豆激酶活力存在显着性差异。然而，大豆蛋白酶解物的促产酶活力不随其水解度的增加而增加。补充NS37071酶解产物，所得发酵产物中纳豆激酶活力较补充胰酶/复合蛋白酶酶解产物高。
发酵时间对纳豆菌液态发酵产纳豆激酶活力的影响
纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶的揺瓶条件为荞麦浸泡6 h后，按料液比1∶10（g/mL）加水打浆，加入0.4%α-淀粉酶，90 ℃加热40 min，补充NS37071酶解12 h时所制得酶解物为氮源，调节发酵培养基pH 7.0，装液量10%，接种量3%，摇床转速180 r/min，发酵温度37 ℃，发酵时间36 h，酶活力从420.12 U/mL提升至756.96 U/mL。
2、2.5 L发酵罐发酵条件的优化结果
当通气量为2.0 L/min时，纳豆激酶活力较低，随着通气量的增加，纳豆激酶活力增加。因通气量较大时容易起泡，选择通气量为3.5 L/min。在通气量不变的条件下，提高搅拌速率可以提高传氧速率，但转速过高，产生的剪切力可能损害微生物菌体，使菌体生长变缓，也可能影响产物活性，选择转速300 r/min。装液量增加至1.5 L时，纳豆激酶活力降低，因此选择装液量为1.2 L。随接种量增加，纳豆激酶活力呈先升高后降低的趋势，因此选择3%接种量。
3、2.5 L发酵罐中菌体生长和代谢特性分析
氮源对纳豆菌发酵过程生物量和比生长速率的影响
添加自制大豆蛋白酶解物与商业大豆蛋白胨组均几乎没有延滞期，立即进入生长对数期，随发酵时间延长，生物量快速增加。商业大豆蛋白胨组发酵18 h后缓慢生长趋于稳定，在24 h时达到最大生物量（5.81 g/L）。而大豆分离蛋白酶解物组发酵前期生长速率较慢，但对数期较长，在30 h左右生物量趋于稳定达到最大值（6.68 g/L）。2 个组别的比生长速率均呈现先增加后降低的趋势，商业大豆蛋白胨组在2.8 h时比生长速率最快（0.92 h-1），而大豆分离蛋白酶解物组在10.8 h时比生长速率最大（0.22 h-1）。
氮源对纳豆菌发酵过程可溶性蛋白含量的影响
可溶性蛋白的消耗速率先增加后减小，其中商业大豆蛋白胨组在发酵9.7 h时对可溶性蛋白的消耗速率最快（0.036 h-1），大豆分离蛋白酶解物组在发酵13.6 h时对可溶性蛋白的消耗速率最快（0.037 h-1）。
氮源对纳豆菌发酵过程还原糖含量的影响
大豆分离蛋白酶解物组在20.85 h还原糖比消耗速率最快（0.053 h-1），而商业大豆蛋白胨组在12 h后还原糖比消耗速率远低于大豆分离蛋白酶解物组。商业大豆蛋白胨组对碳源的利用相对较少，且消耗速率较慢，使得发酵液中碳氮比发生较大变化，不利于后续发酵产酶。
氮源对纳豆菌发酵过程pH值与溶氧的影响
添加自制大豆蛋白酶解物与商业大豆蛋白胨组pH值变化趋势整体上是一致的，初始pH 6.8左右，6 h左右降到最低值随后上升，表明在前6 h，糖类被大量利用，分解成小分子酸、醇，使pH值迅速下降。随着糖类的缺乏，开始大量利用氮源，氨基酸被利用后产生氨气使pH值回升。溶氧量发酵初期急剧下降，因为高浓度发酵下菌体氧需求量大。
氮源对纳豆菌发酵过程纳豆激酶活力的影响
商业大豆蛋白胨作为补充氮源时，24 h达到酶活力最高值（604.61 U/mL），之后酶活力急剧下降；而大豆分离蛋白酶解物组酶活力持续上升至36 h达到最大值（834.91 U/mL）才出现回落。
氮源对纳豆菌发酵过程酚类物质及抗氧化物质含量的影响
随着发酵时间的延长，两组抗氧化物质含量均增加，发酵36 h时，大豆分离蛋白酶解物组的抗氧化活性（27.43 μmol/mL）高于商业大豆蛋白胨组（22.71 μmol/mL），与发酵初期（16.69 μmol/mL）相比，抗氧化活性显着提高。
综上所述，补充大豆分离蛋白酶解物时，纳豆菌生长对数期较长，在30 h左右生物量趋于稳定，达到最大值（6.68 g/L）；纳豆菌对可溶性蛋白与还原糖的消耗量较大，在36 h趋于平稳；纳豆激酶活力持续上升至36 h达到最大值，为834.91 U/mL（152.5 FU/mL），远高于补充商业大豆蛋白胨组（酶活力提高38%）；酚类物质比溶出速率在12 h达到最大值，抗氧化物质比生成速率在6 h达到最大值，发酵36 h时，发酵产物中酚类物质、抗氧化物质含量分别达到0.109 mg/mL及27.43 μmol/mL，远高于补充商业大豆蛋白胨组。
结 论
纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶2.5 L发酵罐最优条件为荞麦浸泡6 h后，按料液比1∶10（g/mL）加水打浆，加入0.4% α-淀粉酶，90 ℃加热40 min，补充NS37071酶解12 h时所得酶解物，调节发酵培养基pH 7.0，接种量3%，通气量3.5 L/min，转速300 r/min，装液量1.2 L，发酵36 h。以荞麦为原料，通过常温浸泡、加水打浆、联合耐高温α-淀粉酶的前处理方法，获得以荞麦为底物的发酵培养基。采用酶法制备大豆蛋白酶解产物，作为补充氮源添加至发酵培养基，通过优化纳豆菌液态发酵条件，可制备具有高纳豆激酶活力（152.5 FU/mL，与商业大豆蛋白胨组相比酶活力提高38%）、富含谷物多酚（0.109 mg/mL）且具有强抗氧化活性（27.43 μmol/mL）的发酵产物。
