来自武汉轻工大学生物与制药工程学院的左正宇、邵洋、刘杨和刘志国*等人通过高脂/高胆固醇饲喂建立NAFLD小鼠模型及添加虾青素的干预模型，研究虾青素对NAFLD代谢异常的改善作用以及对高脂所致的生物节律絮乱的干预作用。对研究虾青素干预对昼夜节律的影响以及针对性地开展虾青素营养干预具有一定意义。
1、虾青素干预对小鼠体质量、肝脏指数以及肥胖指数的影响
与CON组相比，HFD组的体质量高度显着增加（P＜0.001）。AX组小鼠体质量与HFD组相比无明显差异。HFD组小鼠肝脏指数相较CON组高度显着增加（P＜0.001），而AX组与HFD组相比高度显着降低（P＜0.001）。HFD组肥胖指数比CON组高度显着增加（P＜0.001），添加虾青素干预后，肥胖指数极显着降低（P＜0.01）。上述结果表明，高脂饲喂导致了小鼠肥胖及肝脏肥大，使其脂肪沉积增加，而虾青素干预则可显着改善肝脏指数与肥胖指数。
2、虾青素干预对小鼠血脂水平及昼夜节律的影响
高脂/高胆固醇饲喂12 周后，小鼠血清主要血脂水平呈现总体升高趋势（HDL-C浓度下降），尤其以TC和LDL-C浓度升高显着，而经过虾青素干预后，高脂所致血脂异常得到显着改善。进一步观察血脂的昼夜节律变化情况，结果显示不同血脂指标在ZT0（早）、ZT12（晚）间呈现不同的变化规律且差异明显。各组TG浓度在ZT0时均极显着高于ZT12时（P＜0.01，P＜0.001），呈现显着的早晚差异。ZT12时HFD组TG浓度高于CON组，但差异不显着，而AX组TG浓度均显着低于HFD组（P＜0.05）。TC浓度的昼夜节律变化与TG浓度有所不同，各组在ZT0时TC浓度均略低于ZT12时，但无显着性差异。其中HFD组不管在ZT0时还是ZT12时均高度显着高于CON组，而AX组经虾青素干预后TC浓度明显恢复，并在ZT12时显着低于HFD组。LDL-C浓度的变化更为显着，CON组在ZT12时LDL-C浓度显着高于ZT0时（P＜0.05），表明正常饲养时小鼠LDL-C浓度呈现典型的昼夜节律变化；在高脂饲养条件下，LDL-C浓度大幅升高，早晚间的差异消失，虾青素干预则显着降低了LDL-C浓度，但尚未恢复到正常水平和昼夜节律。HDL-C浓度的变化与LDL-C浓度相反，CON组在ZT0时高于ZT12时，HFD组在ZT0时高度显着降低，且昼夜节律消失，而虾青素干预可大幅提高HDL-C浓度。
总地来说，高脂饲喂导致小鼠肝脏血脂水平升高（HDL-C浓度除外），尤其是TC浓度升高明显，而虾青素干预可以有效降低TC和LDL-C浓度，升高HDL-C浓度，改善脂质的代谢。血脂的昼夜节律波动是正常的生理现象，反映了机体昼夜代谢活动的差异，高脂饲养条件下，脂代谢的负荷增加，打破了正常的脂质波动规律，呈现异常的血脂昼夜节律变化。推测虾青素干预能改善脂质代谢，部分恢复血脂水平和正常节律。
3、虾青素干预对高脂诱导的肝损伤的缓解作用
与CON组相比，HFD组小鼠血清中ALT和AST活力均高度显着升高。AX组ALT、AST活力较HFD组极显着降低，但没有回落到CON组水平。表明HFD组小鼠存在显着的肝受损情况，添加虾青素干预则可显着缓解肝脏的损伤。
4、肝脏组织病理学变化分析
HFD组小鼠肝叶细胞肿胀，大小不一的脂滴散布于胞质中，细胞核居边，细胞与细胞之间的界限模糊不清，肝窦狭窄，肝小叶内及汇管区有炎性细胞浸润。AX组脂肪变性与炎性浸润程度较HFD组都有相应减轻。
5、虾青素对肝脏脂代谢相关基因mRNA表达情况的影响
FASN是内源性脂肪酸合成的限速酶，在控制脂肪酸合成中具有重要作用。CON组中FASN mRNA的表达存在显着的昼夜节律变化，即ZT0时（反映动物的活动状态）的mRNA表达量高度显着高于ZT12时（反映动物的休息状态）（P＜0.001）；而在高脂饲养条件下，FASN mRNA表达的节律变化发生显着改变，在ZT0时mRNA表达量极显着低于CON组（P＜0.01），而在ZT12时反而高度显着高于CON组，反映了高脂饲养导致FASN mRNA表达及内源性脂肪酸合成节律的絮乱。经虾青素干预后，FASN mRNA的表达量恢复到正常节律特征（ZT0时高、ZT12时低），并均低于CON组的表达水平，表明添加虾青素干预后，FASN mRNA表达及其代表的内源性脂肪酸合成在ZT0和ZT12时同步受到抑制。
CD36是肝细胞上摄取脂肪酸的受体，其mRNA表达也呈现昼夜节律变化，其在ZT0时的表达量高于ZT12时。而HDF组CD36 mRNA的表达显着上调，早晚间的表达量差异缩小。虾青素干预则可同步增加CD36 mRNA在早晚的表达量。上述结果表明，虾青素对改善高脂条件下内源性脂肪酸的合成和血液中脂肪酸的摄取有显着作用，同时其对高脂所致相关基因表达的节律紊乱有较好的保护作用。
6、虾青素干预对肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA表达与节律变化的影响
HMGCR是胆固醇合成的关键酶，HMGCR节律表达特征与FASN和CD36完全不同，它主要以ZT12时（小鼠的休息时间）的表达为主。正常小鼠HMGCR mRNA水平在ZT12时高度显着高于ZT0时。HFD组HMGCR mRNA早晚的表达都高度显着降低，但以ZT12时为主，此时，胆固醇的合成受到显着抑制，早晚间的波动差距（幅度）减小。AX组有所恢复，但作用并不明显。CYP7A1是胆固醇氧化合成胆汁酸的关键酶，其表达的上调可促进肝脏胆固醇从胆汁中排出。CON组在ZT12时的CYP7A1 mRNA表达量极显着低于光照开始（ZT0）时，而HFD组则主要在ZT12时表达量升高，从而表现出与CON组相反的昼夜节律波动，AX组可以纠正这种波动异常，主要上调ZT0时的表达，与CON组相似。
7、虾青素对肝脏时钟基因mRNA表达量及昼夜节律的影响
CON组CLOCK mRNA的表达存在显着的昼夜节律变化，ZT0时高度显着高于ZT12时（P＜0.001）。高脂饲养条件下昼夜节律消失，在ZT0时HDF组高度显着低于CON组（P＜0.001）；而在ZT12时HFD组略低于CON组，但无显着性差异。CLOCK/BMAL1是生物体内相对保守的、以转录-翻译为基础的自身转录调节回路。BMAL1基因的表达存在着显着的昼夜节律，光照开始时（ZT0），HFD组极显着低于CON组，经虾青素干预后BMAL1mRNA表达量得到高度显着恢复（P＜0.001）；在光照结束时（ZT12）BMAL1 mRNA表达量高度显着低于光照开始（ZT0），且各组间mRNA表达量趋于一致，且无显着差异。高脂饲养条件下，BMAL1 mRNA表达量昼夜节律振幅降低，虾青素干预能改善高脂所致的节律异常。
结 论
与正常组相比，高脂模型组小鼠体质量、肝脏指数、肥胖指数均高度显着增加（P＜0.001），虾青素干预后肝脏指数、肥胖指数均极显着降低（P＜0.01）。高脂饲喂导致小鼠血脂水平升高（HDL-C除外），尤其是LDL-C浓度升高明显，而虾青素干预可以有效降低TC和LDL-C浓度，并升高HDL-C浓度，改善脂质的代谢。高脂/高胆固醇饲喂会高度显着升高小鼠血清ALT、AST活力（P＜0.001），造成肝损伤。与高脂模型组相比，虾青素干预可极显着降低小鼠ALT、AST活力（P＜0.01），缓解肝脏损伤，并明显改善肝脏脂质代谢关键酶的基因表达，包括脂肪酸合成酶和胆固醇合成关键酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶。同时，虾青素干预也增加了胆固醇7α-羟化酶的表达量，促进胆固醇氧化。虾青素调节上述基因的表达具有昼夜节律性，能够缓解或修正由高脂导致的生物钟节律相关因子时钟昼夜节律调节器及脑和肌肉芳香烃受体核转运体样蛋白1以及肝脏脂质代谢关键基因昼夜节律表达的紊乱。本研究表明虾青素具有改善高脂所致肝代谢紊乱的节律性调节作用。
