来自上海应用技术大学食品科学与工程系的陈丽花、朱楚楚和李冉冉以金瓜籽为原料，通过单因素试验及Box-Behnken响应面试验优化了酶法制备APG的工艺参数；将不同分子质量的APG在体外模拟胃肠道消化，分别从产物的游离氨基酸组成、分子质量分布及抗氧化活性变化等角度分析了抗氧化肽在胃肠道消化过程中的生物有效性变化，旨在为APG作为功能性抗氧化剂的生产和应用提供参考。
1、APG制备的单因素试验
1.1 酶种类
分别经4 种蛋白酶酶解相同时间后，碱性蛋白酶酶解金瓜籽蛋白的效果最佳，酶解产物的还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率分别为0.37、43.01%和62.33%。
1.2 底物质量分数
当底物质量分数达到6%时，酶解产物的还原力、羟自由基清除率与DPPH自由基清除率均达到最大值，分别为0.41、47.57%和64.19%。原因可能是底物质量分数低于6%时，底物与酶充分接触发生酶解反应而使还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率逐步升高；当底物质量分数高于6%时，酶量不足以与全部底物发生酶解反应，导致底物不能被充分酶解而降低了酶解产物的抗氧化活性。后续实验选取底物质量分数为6%。
1.3 加酶量
当加酶量为3%时达到最高值，酶解产物的还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率分别为0.40、45.56%和58.45%。这可能是由于进一步酶解反而使具有较高还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率的多肽进一步被降解而导致酶解产物的抗氧化活性下降。后续实验选取加酶量为3%。
1.4 酶解pH值
在实验范围内，当反应体系的pH值为8.5时酶解产物的还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率均达到最高值，分别为0.39、44.19%和55.45%。后续实验选取酶解pH值为8.5。
1.5 酶解温度
酶解温度在55 ℃时酶解产物的还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率均达到最高值，分别为0.42、43.42%和56.68%。但温度高于55 ℃时，酶解产物的还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率急剧下降。
1.6 酶解时间
当酶解90 min时，酶解产物的还原力、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率均达到最高值，分别为0.41、44.67%和54.44%。后续实验选取酶解时间为90 min。
2、APG制备的Box-Behnken试验设计与响应面分析
2.1 响应面试验设计与结果
根据Box-Behnken的中心组合设计原理，选择加酶量（A）、酶解pH值（B）、酶解温度（C）和酶解时间（D）4 个因素为自变量，羟自由基清除率、DPPH自由基清除率和还原力为响应值（Y1、Y2和Y3），设计四因素三水平试验，共29 个试验点，其中试验号2、21、25、27、29为中心试验，用以估计试验误差，其余为分析试验。
2.2 回归方程显着性分析
以羟自由基清除率为响应值时，模型P＝0.0019＜0.01，表明该二次方程模型显着。同时失拟P＝0.0703＞0.1，表示模型失拟不显着，说明响应面试验结果和数学模型拟合度较好，且该回归模型能对APG的制备效果进行较好地分析与预测。用各因素的F值可评价该因素对试验指标的影响，F值越大，说明该因素的影响越显着，即各因素对羟自由基清除率的影响顺序为：酶解pH值＞酶解时间＞酶解温度＞加酶量。变异系数（CV）代表模型的置信度，当CV值小于10%时，说明模型的置信度良好，且CV值越低，模型的置信度越高。本试验的CV值为10.08%，说明本试验的置信度较高。
2.3 酶解条件优化及模型验证
为检验Design Expert软件分析得到最优条件的准确性，对所得最佳酶解工艺条件进行实验验证，即底物质量分数为6%、添加碱性蛋白酶3%、在pH 8.5的体系中55 ℃酶解90 min，所得羟自由基清除率、DPPH自由基清除率、还原力分别为（58.19±0.80）%、（60.27±1.73）%、0.49±0.01，实验值分别与理论预测值（58.75%、60.59%、0.51）接近，说明该模型可较好地模拟和预测APG的制备工艺条件，并具有可行性。
3、模拟胃肠道消化对不同分子质量APG的生物有效性的影响
3.1 对游离氨基酸含量等的影响
分子质量小于3 kDa、3～5 kDa与大于5 kDa的APG样品中分别含游离氨基酸18.97%、12.82%和10.24%，其中分子质量3～5 kDa和大于5 kDa也含有部分游离氨基酸。经过胃部模拟消化2 h后，小于3 kDa的APG中游离氨基酸的总量从64.76 mg/g增加到94.63 mg/g，增幅为46.12%；3～5 kDa的样品中游离氨基酸的含量从43.76 mg/g增加到88.97 mg/g，增幅为103.31%；大于5 kDa的样品中游离氨基酸的总量从34.95 mg/g增加到82.30 mg/g，增幅为135.48%。再经过肠道模拟消化2 h后，小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa的样品中游离氨基酸总量分别增加到142.38、126.06 mg/g和115.80 mg/g，即增加119.86%、188.07%、231.33%。分子质量3～5 kDa和大于5 kDa的样品经胃肠道消化4 h后，含游离氨基酸分别为41.72%、36.94%和33.93%，其余58%以上仍是以肽的形式存在。小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa的样品在模拟胃肠道消化过程中碱性氨基酸（赖氨酸、组氨酸、精氨酸）的释放量较多，酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）的含量基本无变化，具有抗氧化活性的氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸含量增加较明显。
3.2 对APG分布的影响
消化前小于3 kDa的样品中92.68%是分子质量小于3 kDa的肽段，3～5 kDa样品中80.53%是分子质量3～5 kDa的肽段，大于5 kDa样品中85.98%是分子质量大于5 kDa的肽段。小于3 kDa样品在模拟胃消化道过程中，分子质量在500～3000 Da的肽段减少了19.32%，而分子质量小于500 Da的肽段增加了31.15%；在模拟肠道消化过程中，分子质量在500～3000 Da的肽段增加了5.04%（P＜0.05），而分子质量小于500 Da的肽段却增加了86.26%（P＜0.05），消化产物中主要由分子质量小于500 Da的小分子肽段组成。3～5 kDa和大于5 kDa样品消化结果与小于3 kDa的样品结果类似。说明在模拟胃肠道消化过程中，大分子质量的肽段被逐步降解，这意味着胃肠道消化过程中主要通过内切方式对不同分子质量APG进行水解，进一步验证了胃蛋白酶和胰蛋白酶主要是将不同分子质量APG水解成小片段肽，而胰蛋白酶相对于胃蛋白酶而言其水解能力更强。分子质量小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa样品在模拟胃肠道消化过程中分子质量分布的变化规律与其游离氨基酸变化规律一致。而且小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa样品的消化最终产物中分子质量小于500 Da的肽段分别为73.50%、60.15%和53.30%。这说明小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa样品经模拟消化后主要以二肽、三肽和寡肽的形式存在，而不全是游离氨基酸。
3.3 对APG抗氧化活性的影响
3.3.1 APG的羟自由基清除能力变化
小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的空白样品对羟自由基清除能力分别为68.50%、59.39%和47.87%。经过胃蛋白酶消化0.5 h后，其羟自由基清除能力均显着降低，分别为56.25%、49.06%和37.19%（P＜0.05）；继续在胃里面消化1～2 h基本上没有显着改变。但经过第二阶段胰酶消化后，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的样品对羟自由基清除能力分别提高到86.34%、76.65%和64.35%（P＜0.05）。
3.3.2 APG的DPPH自由基清除能力变化
消化前小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的样品对DPPH自由基清除能力分别为70.52%、51.63%和29.74%。经过胃蛋白酶消化0.5 h后，其清除能力分别提高到78.68%、59.34%和44.82%（P＜0.05），进一步用胃蛋白酶消化DPPH自由基清除能力均没有显着提高。在第二阶段模拟肠道消化过程中，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa样品经过胰酶消化0.5 h后，DPPH自由基的清除能力分别从78.93%显着降低至37.24%、从59.68%显着降低至28.24%、从42.93%显着降低至20.24%（P＜0.05）。第二阶段模拟消化结束后，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa样品的消化产物的DPPH自由基清除能力分别只有35.37%、27.63%和20.05%。小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的样品在模拟胃部消化阶段对DPPH自由基清除能力要高于模拟肠道消化阶段。
3.3.3 APG的还原力变化
消化前小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的样品的还原力分别为0.457、0.358和0.291。经过1 h的模拟胃消化后，还原力分别显着降低到0.393、0.336和0.274（P＜0.05），进一步用胃蛋白酶消化1 h而还原力并没有显着变化（P＞0.05）。在第二阶段模拟肠道消化过程中，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的样品经胰酶消化1 h后，还原力分别显着提高至0.674、0.554、0.473（P＜0.05）。整个模拟消化过程结束后，小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa样品的消化产物的还原力比消化前分别提高了50.98%、64.53%、67.35%。模拟胃部消化过程中，小于3 kDa样品比3～5 kDa和大于5 kDa样品具有更高的还原力，可能原因是此阶段3～5 kDa和大于5 kDa样品比小于3 kDa样品具有更多的酸性氨基酸或碱性氨基酸残基，而进入模拟肠道消化阶段，小于3 kDa样品比3～5 kDa和大于5 kDa样品具有更多极性或带电荷的氨基酸侧链基团，从而使其还原力高于3～5 kDa和小于3 kDa样品。
结 论
制备金瓜籽抗氧化肽的最优工艺条件为底物（金瓜籽粕）质量分数为6%、添加碱性蛋白酶3%、在pH 8.5的体系中55 ℃酶解90 min，此条件下所得羟自由基清除率、DPPH自由基清除率、还原力分别为（58.19±0.80）%、（60.27±1.73）%和0.49±0.01；分子质量小于3 kDa、3～5 kDa及大于5 kDa的抗氧化肽经体外模拟胃肠道消化后分别含游离氨基酸41.72%、36.94%和33.93%，其主要为分子质量小于500 Da的肽段，占比分别为73.50%、60.15%和53.30%；与消化前相比，消化产物对羟自由基的清除能力分别提高了26.04%、29.06%和34.43%，还原力分别提高了50.98%、64.53%、67.35%。该研究可为金瓜籽抗氧化肽作为功能性抗氧化剂的生产和应用提供参考。
