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获得高质量的RNA

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-03-10
核心提示:RT-PCR 虽然只是逆转 RNA,但却是决定后续 qPCR 或其他实验成功的关键因素,因此这个步骤不容小觑。
   RT-PCR 虽然只是逆转 RNA,但却是决定后续 qPCR 或其他实验成功的关键因素,因此这个步骤不容小觑。
 
  1、实验过程中避免污染
 
  RNA 中存在的基因组 DNA(gDNA)污染可能是最终 PCR 反应中假阳性结果出现的原因。
 
  通过 DNAase 对提取的 RNA 进行预处理成为唯一的方法。
 
  一方面我们可以通过设计跨内含子的引物去除 gDNA 的影响,但这种方法只适用于含内含子的基因。
 
  2、检测RNA质量质量
 
  一般通过总量,纯度与完整性三大项检测来确认RNA质量:
 
  (1)总量:微量分光光度计测260nm吸收值计算。
 
  (2)纯度:微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值,用于评估有机溶剂残留;260nm/280nm吸收值的比值,用于评估蛋白质污染比例。
 
  (3)完整性:以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis),并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估,10为RNA完整性最好,0为最差。
 
  RNA质检参数中260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。其中:
 
  A230: 测定其它碳源物质,如酚,糖类等。
 
  A260:核酸的吸收峰测,测RNA,DNA,引物等的浓度用的。
 
  A280:蛋白质的吸收峰。
 
  一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)在1.8~2.1范围内时,我们认为 RNA中蛋白的污染是可以容忍的,不过要注意,当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时,R 值可能会大于 2(一般应该是<2.2的)。当R < 1.8时,溶液中蛋白的污染比较明显,可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R > 2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了,而纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。
 
 
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