天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室的彭 博、李炳娟*、关文强*等人采用转录组测序技术对采后4 ℃贮藏第1、7和14天的双孢蘑菇菌盖进行测序，拟从转录组水平分析双孢蘑菇在不同贮藏时间基因的表达差异，进而对这些差异基因进行GO（Gene Ontology）功能和KEGG（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，同时筛选与褐变相关的基因，为今后双孢蘑菇褐变的研究和品质改良等提供一定的理论研究基础。
1、双孢蘑菇贮藏时间褐变度的变化
在4 ℃贮藏时间双孢蘑菇褐变度随贮藏时间的延长呈现逐渐增加的趋势。果蔬采后运输和加工过程中易产生黑色素而引起褐变，会影响果蔬的销售及其营养价值。为进一步探究双孢蘑菇褐变的机理，利用转录组测序技术对其进行后续研究。
2、RNA质量检测
结果可知，所提取的3 组RNA质量较好，可以进行文库构建以及后续测序分析。
3、转录组测序数据统计分析
Pile_C1、Pile_C7、Pile_C14三组转录组测序获得的clean reads中，能定位到基因组上的reads片段有135 603 695 个，占比78.89%～82.5%，在参考序列上有多个比对位置的reads片段有1 627 747 个，占比0.93%～1.04%，在参考序列上有唯一比对位置的reads片段有133 975 948 个，占比77.84%～81.58%，比对到基因组上正链的reads片段有66 778 656 个，占比38.69%～40.67%，比对到基因组上负链的reads片段有67 197 292 个，占比39.16%～40.91%。能定位到基因组上的reads片段中，分段比对到两个外显子上的reads片段有61 654 288 个，占比35.45%～37.83%，整段比对到外显子的reads片段有72 321 660 个，占比41.63%～43.74%。
4、差异表达基因筛选结果
结果可知，Pile_C7与Pile_C1比较，共筛选出727 个差异表达的基因，其中Pile_C7组相对于Pile_C1组上调基因354 个，占总差异表达48.7%，下调基因373 个，占总差异表达51.3%。Pile_C14与Pile_C1比较，共筛选出1 524 个差异表达的基因，其中Pile_C14组相对于Pile_C1组上调基因768 个，占总差异表达50.4%，下调756 个，占总差异表达49.6%。
5、差异表达基因GO富集分析
结果可知，对Pile_C7和Pile_C1组进行显着富集，细胞组分、生物过程和分子功能三大功能类别分别包含了4、16 个和23 个功能分类。细胞组分类别中，富集到胞质的差异基因较多；生物过程类别中，富集到氧化还原过程、磷代谢过程和糖代谢的差异基因较多；分子功能中，富集到水解酶活性、核苷酸结合、核苷磷酸结合和阳离子结合的差异基因较多。对Pile_C14和Pile_C1组进行显着富集，细胞组分、生物过程和分子功能三大功能类别分别包含了8、21 个和19 个功能分类。细胞组分类别中，富集到膜和细胞器的差异基因较多；生物过程类别中，富集到氧化还原过程和有机氮化合物代谢；分子功能中，富集到氧化还原活性和阳离子结合的差异基因较多。
6、差异表达基因Pathway显着性富集分析
双孢蘑菇Pile_C7组与Pile_C1组差异表达基因中共有459 个基因被注释到83 条KEGG代谢通路中；Pile_C14组与Pile_C1组差异表达基因中共有876 个基因被注释到97 条KEGG代谢通路中，其中包含10 条显着性富集代谢通路，分别是类固醇生物合成、氨酰-tRNA生物合成、抗生素生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、果糖和甘露糖代谢、氧化磷酸化、半乳糖代谢、甘油脂代谢、磷酸戊糖途径和次生代谢产物的生物合成，这些途径大都与双孢蘑菇生理代谢相关。
7、褐变相关差异表达基因筛选
从3 组双孢蘑菇菌盖在不同贮藏时间的差异表达基因中筛选出与多酚氧化酶相关的基因有5 个，这些基因包括多酚氧化酶基因和漆酶基因。其中，PPO3（18 085 507）在贮藏第7天时表达量最低，在贮藏第14天时基因表达量上调，这与前人的研究结果一致。PPO1（18 082 695）在贮藏时间表达量下调。LAC4（18 085 498）、PPO5（18 078 406）和LAC1（18 080 537）3 个基因表达量在贮藏期间呈上调趋势，且在第7天和第14天期间基因表达量显着上调。
8、双孢蘑菇贮藏时间PPO活性变化
双孢蘑菇PPO活性随贮藏时间的延长逐渐增强。前人的研究结果表明AbPPO1基因表达的影响模式与其对褐变度和PPO活性的影响模式不一致，而AbPPO3基因与褐变度和PPO活性的影响模式一致，认为AbPPO1基因可能不参与双孢蘑菇褐变的形成，AbPPO3参与双孢蘑菇的褐变。
结 论
4 ℃ 贮藏时间双孢蘑菇褐变度随贮藏时间的延长呈现逐渐增加的趋势，并对此条件下的双孢蘑菇菌盖转录组进行Illumina HiSeqTM高通量测序，共获得176 329 392 个raw reads，168 607 212 个高质量的clean reads。按照︱log2（两组样品表达量比值）︱＞1且q＜0.005的原则，Pile_C7与Pile_C1组共筛选出727 个差异表达基因，Pile_C14与Pile_C1组共筛选出1 524 个差异表达基因。GO功能富集结果显示，Pile_C7与Pile_C1组中，胞质、氧化还原过程和水解酶活性分别是细胞组分、生物过程和分子功能富集最多的条目；Pile_C14与Pile_C1组中，膜、氧化还原过程和氧化还原活性分别是细胞组分、生物过程和分子功能富集最多的条目。Pathway富集分析发现，Pile_C7与Pile_C1组中459 个差异表达基因被成功注释到83 条KEGG代谢通路中；Pile_C14与Pile_C1组中876 个差异表达基因被成功注释到97 条KEGG代谢通路中，其中10 条为显着富集通路（P＜0.05）。从获得的差异表达基因中筛选得到5 个多酚氧化酶相关基因，PPO3、PPO1、PPO5、LAC1和LAC4。双孢蘑菇多酚氧化酶活性随贮藏时间的延长逐渐增强，与转录组测序结果有一致性。研究结果为进一步分析差异基因与褐变的调控关系，及为双孢蘑菇品种改良提供科学依据。
