本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法。
本标准适用玉米、小麦及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速筛选测定。
第一法 比色法
2.原理
本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（T线）、控制线（C线）的颜色深浅对比进行结果判读。
3.试剂及材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1.试剂
3.1.1.乙腈。
3.1.2.甲醇+水（7+3，体积比）。
3.1.3.稀释缓冲液（胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液或根据产品使用说明书配置）。
3.2.参考物质
3.2.1.玉米赤霉烯酮的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥95%。
表1 玉米赤霉烯酮参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
注：或等同可溯源物质。
3.3.标准溶液的配制
3.3.1.标准储备液：称取适量标准品，用乙腈（3.1.1）溶解，制成浓度为100 μg/mL的标准储备液。﹣18 ℃避光保存，有效期6个月。
3.3.2.标准工作液：准确量取标准储备液（100 μg/mL）（3.3.1）100 μL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 μg/mL的玉米赤霉烯酮标准工作液，2～8 ℃避光保存，有效期1个月。
3.4.材料
玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为玉米、小麦及其碾磨加工品。
4.仪器和设备
4.1.移液器：100 μL、200 μL 、1 mL和5 mL。
4.2.旋涡混合器。
4.3.离心机。
4.4.电子天平：感量为0.01 g。
5.环境条件
环境温度：20～30 ℃。
空气相对湿度：最佳测定湿度45%～65%。若湿度低于45%，相应延长待测液-试纸条反应时间，以质控实验为准；若湿度为65%～80%，微孔与试纸条拆开后立即使用，避免微孔与试纸条长时间暴露在空气中受潮，避免高湿环境下（湿度80%以上）进行实验。
6.分析步骤
6.1.试样制备
取适量样品，充分碾磨或粉碎混匀，过40目筛。
6.2.提取
准确称取试样5.0 g（精确至0.01g）于50 mL离心管中，加入20 mL 甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3 min，离心分层或静置分层，上清液备用。
准确移取0.8 mL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5 mL离心管中，加入25 μL上清液，混匀，待检。
6.3.测定步骤
依检验所需，取相应数量的金标微孔和试纸条，做好标记。吸取待检液200 μL于金标微孔中，抽吸至孔底的紫红色颗粒完全溶解，孵育10 min。将试纸条插入金标微孔中，反应3 min～5 min。
从金标微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色结果，进行判定。（若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验操作环境温度。）
7.质控试验
每批样品应该同时进行空白试验和阳性质控试验。
7.1.空白试验
准确称取空白试样，按照6.1和6.2步骤与样品同法操作。
7.2.阳性质控试验
准确称取玉米赤霉烯酮含量为60 μg/kg的质控样，按照6.1和6.2步骤与样品同法操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量为60 μg/kg，按照6.1和6.2步骤与样品同法操作。
8.结果判定
通过对比控制C线和检测T线的颜色深浅进行结果判定。
8.1.无效结果
无论样品中有无玉米赤霉烯酮存在，C线都会出现一条紫红色条带。若控制C线未显色，表明操作过程不正确或试纸条已失效，检测结果无效。
图1 试纸条目视判定图
8.2.阳性结果
控制C线显色，检测T线显色比C线浅或者没有颜色，判定为阳性。
8.3.阴性结果
控制C线显色，检测T线显色比C线深或者一致，判定为阴性。
图2 试纸条目视判定图
8.4.质控试验要求
空白试验结果应为阴性，阳性质控试验结果应为阳性。
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第二法 消线法
9.原理
本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过T线显色与否进行判读结果。
10.试剂及材料
同3。
11.仪器和设备
同4。
12.环境条件
环境温度：10～40 ℃。
空气相对湿度：同5。
13.分析步骤
13.1.试样制备
同6.1。
13.2.提取
准确称取试样5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入12.5 mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3 min，离心分层或静置分层，上清液备用。
准确移取400 μL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5 mL离心管中，加入上清液(小麦50 μL，玉米80 μL），混匀，待测。
13.3.测定步骤
同6.3。
14.质控试验
同7。
15.结果判定
通过检测T线显色与否进行结果判定。
15.1.无效
同8.1
15.2.阳性结果
控制C线显色，检测T线不显色，判定为阳性。
15.3.阴性结果
控制C线显色，检测T线显色，判定为阴性。
图3 试纸条目视判定图
16.质控试验要求
同8.4
17.结论
本方法筛查出的阳性样品进行确认时，应按GB 2761指定方法标准检测并判定。
18.性能指标
18.1.检出限：60 μg/kg。
18.2.灵敏度：灵敏度≥95%。
18.3.特异性：特异性≥90%。
18.4.假阴性：假阴性≤5%。
18.5.假阳性：假阳性≤10%。
注：性能指标计算方法见附录A。
19.其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，满足本方法规定的各项性能指标时方可使用。
本方法参比标准为GB 5009.209-2016 食品安全国家标准 食品中玉米赤霉烯酮的测定。
