本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。
2 原理
本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。
3 试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。
3.1 试剂
3.1.1 正己烷。
3.1.2 丙酮。
3.1.3 乙酸乙酯。
3.1.4乙腈
3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。
3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。
3.1.7 氯化钠
3.1.8 复溶液：称取0.12g磷酸二氢钠 (3.1.5)置于100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16g (3.1.6)置于100ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A 2.8ml、溶液B 7.2ml、氯化钠(3.1.7)0.85g，用水溶解并稀释至100ml，得磷酸盐缓冲液。
3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。
3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。
3.2 标准物质
氯霉素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%
表1 氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量
注：或等同可溯源物质。
3.3标准溶液配制
3.3.1 氯霉素标准储备液（1 mg/mL）：精密称取氯霉素标准品（3.2）适量，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 mg/mL 的氯霉素标准储备液。4℃避光保存，有效期6个月。
3.3.2 氯霉素标准中间液A（10μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1 mg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成 10 μg/mL的氯霉素标准中间液A。4℃避光保存，有效期3个月。
3.3.3 氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10μg/mL）（3.3.2）0.01 mL分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01 μg/mL的氯霉素标准工作液。临用新配。
3.4材料
3.4.1固相萃取小柱：Cleanert Silica，200mg/6ml。LOT：0170198
3.4.2免疫胶体金试剂盒（在2℃～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）。
3.4.2.1 金标微孔。
3.4.2.2 试纸条或检测卡。
4 仪器和设备
4.1 移液器：200 μL、1 mL 和5 mL。
4.2 涡旋混合器。
4.3 离心机：转速≥4000 r/min。
4.4 电子天平：感量为 0.01 g。
4.5 振荡器。
4.6 样品浓缩仪：如有需要。
4.7环境条件:温度：15℃～25℃，相对湿度：≤60%。
5分析步骤
5.1试样制备
取具有代表性样品约500 g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。
5.2试样提取和净化
准确称取试样6g（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入4mL水和8mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5min，以4000r/min 离心5min。转移全部乙酸乙酯层于50mL具塞离心管中，加入正己烷25ml，氯化钠1g涡旋混匀，4000r/min 离心1min，上清液待净化。5ml丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5ml丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40℃氮气吹干，精密加入600?L复溶液（3.1.8），涡旋混合1min，作为待测液。
5.3 测定步骤
5.3.1 检测卡与金标微孔测定步骤
吸取150?L样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸 5～10 次使混合均匀，室温温育3 min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8 min，对结果进行判定。
5.3.2 试纸条与金标微孔测定步骤
吸取150?L样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10 次使混合均匀，室温温育3 min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育3 min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于5 min内进行结果判定。
5.3.3 检测卡测定步骤
吸取150?L样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8 min，对结果进行判定。
5.4质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
5.4.1 空白试验
称取空白试样，按照 5.2和5.3 步骤与样品同法操作。
5.4.2 加标质控试验
准确称取空白样品 6 g 或适量（精确至0.01g）置于50 mL 具塞离心管中，加入60 μL氯霉素标准工作液（0.01μg/mL）（3.3.3），使氯霉素浓度为0.1 μg/kg，一式2份，按照 5.2和5.3 步骤与样品同法操作。
6 结果判定要求
通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。
6.1 无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
6.2 阳性结果
检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，判定为阳性。
6.3 阴性结果
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。
6.4质量控制要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。
7 结论
如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。
8 性能指标
8.1 检测限：氯霉素为0.1 μg/kg。
8.2 灵敏度：灵敏度应≥98%。
8.3 特异性：特异性应≥90%。
8.4 假阴性率：假阴性率应≤1%。
8.5 假阳性率：假阳性率应≤10%。
注：性能指标计算方法见附录A
9其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定 (包括所有修改单)。
