1. 前天晚上先制备好两块跑电泳用的SDS-PAGE凝胶板于4℃下备用（配胶需参照试剂盒、操作的规范性、凝胶时间下层1h，上层30mim、每次加入试剂时均需混匀、插胶梳时需要从一侧缓缓向另一侧插入，避免出现气泡、在倒去压胶所用ddH2O后，应倒置沥干水，方可加入上层胶，注意控制加入速度）； 2. 制备冰盒备用、取离心管支架、1.5ml离心管、0.6ml离心管备用、镊子备用； 3. 提取蛋白及蛋白定量，4℃离心30min（提前预冷30min）；（此步及下续均于冰上操作）
4. 吸取上清液于对应已标记好的1.5离心管中，置冰上离心管架备用；
5. 每个样品蛋白提取液对应8个0.6ml离心管，对应标记(标记内容应予各自的初管一致)为1~8备用；
6. 每0.6ml离心管分装100ul蛋白提取液，留对应俩管下续操作，其余均封口，再置于-80℃下保存；
7. 给剩下的俩管中各加入25ul loading buffer（5X）（1：4稀释成1X），吹打混匀，闭盖、放在加热器上100℃下煮沸10min（提前预热到100℃），后离心、于室温下冷却到室温；
8. 组装好电泳胶板玻板、检漏、插入电泳槽内、俩玻板间加新配电泳液直至没出；
9. 小心拔胶梳，加样：mark 加5ul 、其余各样品加10ul; 10. 80V电压先跑30min（以mark彻底分开为准）、再转110V电压跑一个小时（以红色mark标记下仅剩下俩条带为准）；
做转膜前的准备工作：
1. 预先配好转膜液（1X）及分装好PVDF膜激活液，置于4℃下预冷备用； 2. 裁剪好适合尺寸滤纸并湿润备用；准备好：平口镊子、切胶板、盛转膜液的白色瓷盒子、盛激活液的小盒子、转膜用压合器、小剪刀备用；
3. 到适量转膜液于白瓷盒中备用，取下已电泳好的玻璃板，用切胶板小心分开俩玻璃板，留上附有胶的玻板，切去多余的胶(切平整)，测量剩余胶块尺寸记录备用，并用切胶板从胶的有mark侧一角小心的铲起，转入转膜液中（轻柔，不可弄破）；
4. 以胶块略小尺寸裁剪好PVDF膜（一角剪去以作标记），并将其小心平铺于已倒入了激活液的塑料盒子中，激活1min（不可出现气泡）；再用平口镊将其夹入转膜液中平衡数分钟，同时将准备好的滤纸放入转膜液中备用；
5. 打开转膜压合器，黑板面先放好海绵，将转膜液中的胶片转移到湿润的滤纸上（动作轻柔、并用切胶板于下端支持），马上连同滤纸小心放在黑面海面上，小心用镊子夹取PVDF膜一角，并将缺口侧对齐mark无气泡敷好；
6. 与膜上盖好另一片滤纸、海绵，并小心地合上转膜压合器，固定，黑面和黑的配好组装装；
7. 加转膜液并将白瓷盒中转膜液也加入电泳槽，直至与其上肩部齐平，合盖；
8. 110V 、120min转膜；
封闭
1. 洗膜：用ddH2O室温漂洗5min（注意正反），以洗去转印膜上的SDS，以防止后续的抗体结合（此步及下步在摇床上）；
2. 封闭：取一步转印膜，正面朝上，置于封闭液中，摇床、室温封闭1h； 剪膜：封闭完毕后用剪刀小心剪下含目的条带的PVDF膜，依次转入专用盒子中（分别做好标记），以备下步操作；
敷一抗（1：1000）:于4℃下进行蛋白膜和一抗的结合反应，以缓解一抗衰减速度；（敷一扛过夜）
洗膜：回收一抗剩余抗体于特定管中，标记，4度保存，后分别倒入适量洗膜液（浸没即可），摇床，5min，弃洗膜液，再倒入新的洗膜液（如此5次），最后一次后小心甩干洗膜液，进入下步操作； 敷二抗（1：1000）：向反应槽中分别加入二抗稀释液（只要浸没即可），于室温下反应1h；
洗膜：回收二抗剩余抗体于特定管中，标记，4度保存，后分别倒入适量洗膜液（浸没即可），摇床，5min，弃洗膜液，再倒入新的洗膜液（如此5次），最后一次后小心甩干洗膜液，进入下步操作；
扫膜：
（1） 配显影液（BeyoECL Star）:A液：B液=1:1混合(500ul/膜)（此步需避光）；
（2） 提前开启扫膜仪预冷到-30℃(需打开程序)；
（3） 将目标条带正面转移至操作台目标位置，均匀滴加显影液于表面，扫膜拍照；
