最初对冷鲜肉微生物多样性的研究方法多数停留在传统的分离培养和传统分子生物学方法上，且大部分集中在冷鲜牛肉、羊肉、猪肉及各种水产类研究上（鱼、虾、贝等）。然而，近年来，随着测序技术的发展，高通量测序技术在微生物群落研究方面表现出越来越突出的优势，目前已广泛应用于医学、环境水土污染、人体胃肠道等多个方面。虽然在食品领域的应用尚处于初期阶段，但在近几年来发展迅速，尤其对肉制品、水产品、发酵类食品中的细菌群落多样性有着越来越多的研究。
目前采取的细菌增菌温度多为37 ℃，而对于以嗜冷菌和嗜温菌为主导的低温贮藏冷鲜鸡肉来说，培养温度为（36±1）℃多为嗜温菌生长繁殖，而嗜冷菌生长在一定程度上被抑制，其所得微生物检测结果并不能完全客观地反映出冷鲜鸡肉的卫生质量。倘若能对冷鲜鸡肉嗜冷菌和嗜温菌进行全面检测，并结合两者测定结果作综合评价，这样可以对冷鲜鸡肉的卫生质量有个更为完善的认识。因此，仲恺农业工程学院轻工食品学院的温冬玲、成淑君、刘 悦、余 倩*选取4 ℃和37 ℃两种增菌温度，研究比较不同贮藏时间的冷鲜鸡肉群落多样性差异及菌群演替变化规律，以期为冷鲜鸡肉低温贮藏过程或贮藏温度失控情况下有效实施冷鲜鸡肉质量安全控制提供理论基础。
1、测序数据统计与OTU分析
14 个样品经过测序后得到的下机序列总数为261 968 个，其中有效序列总数达154 610 个，且每个样品的有效序列数均达到10 000以上，有效序列百分比都达50%以上。这说明本次测序所得到的有效序列可以达到后续微生物多样性分析的要求。样品同一贮藏时间的冷鲜鸡肉在4 ℃得到的OTU数目普遍比37 ℃多，说明在4 ℃冷鲜鸡肉中的微生物多样性比37 ℃下更丰富。同一增菌温度下比较，不同的贮藏时间得到的OTU数目不同，其中在贮藏后期（10～12 d）得到的OTU数目较大，可能是由于在贮藏后期冷鲜鸡肉发生了腐败变质，而引起腐败变质的微生物种类较多。
2、不同增菌温度下冷鲜鸡肉细菌群落的Alpha多样性分析
Chao I、ACE、Shannon指数在4 ℃数值普遍高于37 ℃的，Simpson指数刚好相反，表明在4 ℃获得的微生物群落多样性与丰富度比37 ℃高。其中Chao I、ACE指数值最大为样品4d2，其次为样品4d12，数值最小为样品37d0，说明4 ℃贮藏第2天的冷鲜鸡肉物种丰富度达到最高，可能是由于此时冷鲜鸡肉中营养成分含量较高，细菌迅速生长繁殖，甚至达到细菌的对数生长期；而贮藏第12天物种丰富度也比较高，可能是由于冷鲜鸡肉此时已沦为腐败，腐败菌含量迅速增加，占主要优势。对于Shannon指数，最大为样品4d10，其次为4d6与4d12，最小为37d0，而Simpson指数变化则相反。这说明了4 ℃冷鲜鸡肉贮藏10 d微生物多样性最高，37 ℃冷鲜鸡肉贮藏第0天微生物多样性最低。
3、不同增菌温度下细菌群落结构分析
基于门分类水平上进行分析
不同贮藏时间的冷鲜鸡肉微生物菌群在4 ℃和37 ℃得到的菌相主要由变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）3 大菌门组成。根据各样品在门水平菌群比例分布图可以看出，不同贮藏时间的冷鲜鸡肉在不同增菌温度下微生物菌群组成存在较大的差异，但也存在一定的共性，其中Proteobacteria和Firmicutes广泛存在于14 个单样品中，并且占据优势。Proteobacteria相对丰度在48.97%～97.17%范围内，且不同贮藏时间及增菌温度下所占比例也不尽相同，其中在4 ℃贮藏第0、4天和37 ℃贮藏第12天所占比例较大，分别为88.71%、97.17%和88.43%。其次是Firmicutes，它在冷鲜鸡肉贮藏前期（0～4 d ）总体含量较贮藏中期（6～8 d ）、后期（10～12 d ）高；到贮藏中期时，Bacteroidetes迅速增加，所占比例远大于Firmicutes，最高达到48.97%，成为第2大优势菌门，说明随着贮藏时间延长，Bacteroidetes对冷鲜鸡肉的腐败变质起了越来越大影响，与目前已有的相关研究结果一致。
基于属分类水平上进行分析
在4 ℃和37 ℃微生物菌群种类和丰度大小存在较大的差异性。在4 ℃冷鲜鸡肉主要以Pseudomonas、Shewanellaceae、Acinetobacter、Myroides及其他未知菌菌属为主；其中Pseudomonas占最大的比例，最高达44.03%，为冷鲜鸡肉贮藏过程中的主要优势菌群，与目前大多数冷鲜肉优势腐败菌研究结果一致。其次为Shewanellaceae、Acinetobacter，最高分别占菌群的38.23%、24.64%。
4、冷鲜鸡肉贮藏中不同增菌温度下细菌群落的PCA
PC1与PC2的贡献率分别为40.83%和21.55%，说明这两个主成分是解释样品微生物群落结构组成差异的主要因素。不同贮藏时间及不同增菌温度下的各个样品能明显地分离，表明各个样品间微生物群落结构组成具有一定的差异，其中在PC1方向上，4 ℃和37 ℃的样品能够显着地分布在两个区域，说明细菌增菌温度在PC1水平上对样品菌群结构变化影响显着；而在PC2上，不同贮藏时间的样品区分明显，这说明不同贮藏时间在PC2水平上对样品菌群结构变化影响显着。同一增菌温度下贮藏前期（0～4 d）的样品与贮藏中期（6～8 d）、贮藏后期（10～12 d）样品之间分布距离较大，主要是由于冷鲜鸡肉在贮藏前期仍处于鲜肉与次鲜肉状态，而在贮藏中期开始发生腐败，直到贮藏后期完全腐败，进而导致冷鲜鸡肉群落结构组成发生了较大变化。
结 论
本实验对不同贮藏时间的冷鲜鸡肉细菌在4 ℃和37 ℃条件下的增菌液进行细菌基因组DNA提取，并通过基于16S rDNA基因的高通量测序技术分析。结果表明：4 ℃与37 ℃条件下微生物群落多样性与演替规律存在较大差异。共鉴定到细菌5 门、12 纲、20 目、39 科、53 属。在门水平上，均以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为优势菌门。在属水平上，4 ℃增菌温度下，贮藏前期（0～4 d）冷鲜鸡肉以Pseudomonas、Shewanellaceae、Acinetobacter为主要的优势菌，其中Pseudomonas占最大的比例，最高达44.03%，为冷鲜鸡肉贮藏前期优势菌；在贮藏中后期，Myroides迅速增加，在12 d达到最大，大于Pseudomonas，成为影响冷鲜鸡肉贮藏中后期腐败变质的主要菌属。而在37 ℃条件下，Citrobacter、Proteus、Lactococcus、Bacteroides在贮藏前期含量相对较大，到贮藏中后期，主要以Myroides、Wohlfahrtiimonas为主，而Wohlfahrtiimonas在贮藏前期未检出或含量很低，在贮藏后期所占比例逐渐增大，在12 d达到最大值30.19%，加促了冷鲜鸡肉的腐败。
