菌落总数测定是用来判定食品样品被微生物污染的程度及卫生质量,尤其某些对环境因素(如干燥、加热等)抵抗力强的微生物(如芽孢类)可在食品样品中长期存活,此检测结果常需是食品样品生产加工过程中卫生状况的客观记录,检测结果可用于评价被检样品的卫生学状况,菌落总数的多少在一定程度上标志着食品样品在生产、运输、储存等环节卫生质量的优劣。
01
仪器与耗材(仅列出标准中不明确或缺少内容)
a.样品稀释液
样品稀释液指磷酸盐缓冲液(pH7.2±0.2)或0.85%生理盐水(具体配方见GB 4789.2-2016)
b.涡旋混匀器
c.拍打式均质器或刀头式均质器
d.自动平皿旋转仪
e.菌落计数仪
02
检验步骤
2.1 固体和半固体食品样品
2.1.1 用天平无菌称取25g±0.1g样品。
2.1.2 如使用刀头式均质器,可将样品加入盛有225mL样品稀释液的无菌均质杯内,
80000~10000r/min均质1-2min,制成1:10的样品匀液。
2.1.3 如使用拍打式均质器,可将样品加入盛有225mL样品稀释液的无菌均质袋中230r/min拍打1-2min,制成1:10的样品匀液。
2.2 液体样品
2.2.1 用无菌吸管吸取25mL±0.1mL样品。
2.2.2 如使用锥形瓶,可将样品加入盛有225mL稀释液的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。
2.2.3 如使用拍打式均质器,可将样品放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,230r/min拍打1-2min,制成1:10的样品匀液。
2.3 用1mL无菌吸管取1:10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的试
管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)。
2.4 换用1支1mL无菌吸管反复吹打10次以上;或旋紧试管盖,用涡旋混匀器高速混匀5秒钟以上,或使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。
2.5 依照上述操作,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,均换用新的1mL无菌吸管。
2.6 根据样品污染状况或产品限量标准要求,选择不少于3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）进行培养检测。
2.7 如果样品匀液静置超过3分钟应重新混匀,依次吸取1mL样品匀液于明确标识的无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。
2.8 分别吸取1mL空白稀释液加入两个明确标识的无菌平皿内做空白对照。
2.9 将高压灭后的平板计数琼脂培养基从高压钢中取出,摇匀，置于46℃±1℃温水溶箱中保温1小时以上、以保证培系基的温度降低到46℃±1℃。
2.10 取冷却至46℃±1℃的平板计数脂培养基,混匀，倾注明确标识的无菌平皿中,每个平皿倾注15-20mL培养基。
2.11 立刻在水平桌面上旋转和前后移动平皿,使培养基与样品充分混合均匀。
2.12 待琼脂彻底凝固后,将平板翻转,置于培养箱中，36℃±1℃培养48h±2h。
若为水产品,则在30℃±1℃条件下,培养72h±3h。
2.13 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖4mL琼脂培养基,凝固后翻转平板,按上述条件进行培养。
03
结果计数
3.1 应对平皿上所有肉眼可见的菌落进行计数
3.2 平板上菌落计数可使用自动化菌落计数仪,也可用肉眼观察(必要时可用放大
镜观察)记录培养基上菌落数量和相应的稀释倍数。
3.3 选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
3.4 如果在一个稀释度的两个平板中,一个平板的菌落数在30-300之间,另一个大于300或小于30时,则以30-30之间平板菌落数作为本稀释度结果记录。
3.5 如所有平板的菌落数均在30CFU以下,则记录平板中具体的菌落数;如果没有菌落生长,则记录为小于1CFU。
3.6 如平板上菌落数大于300CFU,则记录为多不可计;但如果所有稀释度的平板上落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数、其他稀释度平板记录为多不可计。
3.7 同一稀释度的两个平行平板中,一个平板有较大片状落生长时、应不进行计数，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。
3.8 如果同一稀释度的两个平行平板均有片状菌落生长,选取片状菌落不到平板一半，而剩余一半落分布均匀的平板,计数一半平板落数并乘以2代表全皿菌落数。
3.9 当平板上出现菌落同无明显界线的状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
04
结果计算
4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在30-300CFU之间,计算两个平板菌落数的
平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。
4.2 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘
以稀释倍数计算。
4.3 若所有稀释度的平板菌落数均大于300CFU,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.4 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低
稀释倍数计算。
4.5 若所有稀释度的平板菌落数均不在30-30CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.6 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,除30-300FU范围之外的平板,按如下公式计算:
05
结果报告
5.1 菌落计数以落形成单位(colony-forming units，CFU)表示,称重取样以CFU/
g为单位报告,体积取样以 CFU/ml为单位报告,表面取样以 CFU/cm2为单位报告。
5.2 菌落数小于100CFU时，按”四舍五入”原则修约，以整数报告。
5.3 菌落数大于或等于100CFU时,将第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数,也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
5.4 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落延。
5.5 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
注：菌落总数结果计算与报告方式实例见表2.1
06
质量控制
1.实验过程中,每批样品稀释液都要做空白对照。如果空白对照平板上出现菌落时,应废弃本次实验结果,并对稀释液、吸管、平皿、培养基、实验环境等进行污染来源分析。
2.为了控制环境污染,在每次检验过程中,于检验工作台上打开两块计数琼脂平板,并在检验环境中暴露不少于15分钟,将此平板与本批次样品同时进行培养,以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
3.在检测食品样品稀释液中有颗粒的样品时,为了避免菌落计数时食品颗粒与细菌菌落发生混淆,可将样品稀释液与计数琼脂混合,放置于4℃环境中,以便在计数菌落时用作对照。
4.定期使用大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC6538和枯草芽孢杆菌ATCC6633或相应定量活菌参考品,在P2实验室或用阳性对照实验室内,用适当的食品样品进行阳性对照实验验证,并进行记录,此验证实验至少每2个月进行一次。
