首先，对流动相溶液的准备提出几点意见。
只有纯水溶液部分才能正确调整pH值。不要尝试测量或调整有机或有机混合物的pH值。
制备二元混合物的方法有两种，即V/V流动相溶液。
方法#1是用特定体积的“A”溶液填充一个量瓶，然后用“B”溶液将量瓶填满。
方法#2是用指定数量的“A”溶液填充量筒(或容量瓶)；用指定数量的“B”溶液填充第二个量筒(或容量瓶)，然后将两者的内容混合在一起。
无论您使用哪种方法，请在您的高效液相色谱法中完整地记录它，以便任何阅读它的人都能准确地复制它。上面描述的两种方法在设计上都是正确的，但是会产生不同性质的结果。
紫外线吸光度
对于HPLC级溶剂(我们在HPLC分析中应始终使用HPLC级溶液)，乙腈的吸光度在这两种溶剂中最低，非常适合低紫外光分析。甲醇在205-210nm左右有较高的紫外光吸收值，在非常低的紫外光范围内略有限制。
溶剂溶解性
乙腈和甲醇在溶解多种缓冲盐和样品的能力上存在显着差异。这些差异在方法开发中至关重要。
1.流动相溶解度
梯度运行显示低重现性或失败的一个常见原因可能与运行高浓度缓冲液和高浓度有机溶液有关。而含有浓度小于10mM盐溶液的水溶液/有机溶液在大多数梯度条件下不太可能沉淀（最多98%是有机溶剂，而不是100%)，大多数与高效液相色谱应用一起使用的缓冲溶液会有更高的盐浓度，当分析条件中有机溶剂含量较高时可能会从溶液中析出（导致堵塞，泄漏，插头和不准确的结果）。在反向色谱法中选择有机组成时要谨慎。确保使用的溶液在所有浓度下都是稳定的。还要验证缓冲能力是否仍然存在，当使用高有机浓度时(当缓冲液被稀释时)。
不确定盐是否会溶解?只要把同样浓度的溶剂混合起来做测试就行了。观察它，有任何浑浊或可见颗粒吗?你就可以得到你需要的答案。
甲醇总体上具有更好的溶解度特性(优于乙腈)，这意味着它在较高浓度下能更好地溶解大多数盐，从而获得更好的性能和更少的沉淀。
2.样品的溶解度(对峰形和保留的影响)
液相色谱的一个基本要求是样品完全溶解在流动相(初始流动相)中。在分析前，将样品溶解在流动相或强度稍弱的溶液（不是更强的溶液）。这确保它将作为一个集中的段塞加载到柱的顶部，以改善峰形和RSD。如果样品没有完全溶解在流动相，那么你实际上并没有分析整个样品。甲醇优于乙腈的另一个方面是它能完全溶解更多类型的样品。这一改进的溶解度可能导致更好的整体峰形。甲醇的选择性也不同于乙腈(不仅仅是洗脱强度)，这可能导致峰洗脱时间与预期的保留时间不同。这也是为什么在开发反向方法时，我们总是尝试使用含有乙腈或甲醇的不同流动相混合物的另一个原因。
永远不要假设一种溶剂会比另一种溶剂更好。太多的色谱新手只使用乙腈作为他们方法开发的主要有机溶剂。请不要犯他们的错误，这样的策略表明缺乏实践经验和知识。您必须首先分别尝试它们（乙腈&甲醇）用你的样品来评估结果（在适用的情况下最好从不同pH值的全面梯度开始）。如果您在最初的时间内测试了这两种类型的溶剂，那么将获得回报，因为还没有开发出能够使用您自己的样品来预测真正准确的结果的模拟器。可能会惊讶地发现，有多少样品使用甲醇溶液显示出更好的峰形和性能。如果没有看到任何改善，至少你现在知道了，因为你已经尝试过了，并且可以满怀信心地前进。
背压
乙腈的粘性比甲醇小，因此通常会导致整体柱压和系统背压降低。乙腈和水的混合物也会发生吸热反应(冷却溶液)，从而在溶液中捕获气体。如果你预先混合你的流动相，让它静置几分钟后在制备。
甲醇比乙腈更粘稠。它还有一个不寻常的特性，就是甲醇和水的50/50混合物会产生一个比甲醇或水更高的系统和柱背压。它的峰值压力是由50/50的混合物所观察到的。两种溶液在开始混合释放出一些气体也会产生放热反应。在制备溶液时，最好是让溶液静置几分钟，然后在高压液相色谱系统中使用。
希望这篇关于这两种常用高效液相色谱溶剂的差异的简短讨论将有助于您开发出更好的高效液相色谱和LC-MS方法。
