单一菠萝蛋白酶和超声波处理对肉的嫩化均有效果，同时，超声波对菠萝蛋白酶的性质有一定的影响，然而目前为止，两者协同作用对肉的嫩化作用方面的研究还很少。因此，淮阴工学院生命科学与食品工程学院赵 立、周 振、贺倩倩等人利用超声波协同菠萝蛋白酶对鸭肉的嫩化工艺进行研究，并对嫩化机理进行探讨，为肉品的嫩化提供更多更有效的方法。
1、超声波与菠萝蛋白酶协同作用对鸭肉的嫩化工艺结果
单因素试验结果
温度对鸭肉嫩化效果的影响
随着嫩化处理温度的升高，在达到40 ℃时剪切力达到最低（23.997 N），显着低于其他各组（P＜0.05）。尽管菠萝蛋白酶的最适作用温度范围为55～60 ℃，由于超声波在工作期间产生的热效应会使处理温度上升，同时超声15 min可以大大增加酶的活性，因此，随着处理温度上升到60 ℃时，实际温度已大于60 ℃，鸭肉蛋白质在此温度条件下可能已发生变性，菠萝蛋白酶发生失活，剪切力显着增加（P＜0.05）。因此，最佳温度在40 ℃左右。
嫩化时间对鸭肉嫩化效果的影响
随着鸭肉嫩化时间的延长，15 min时鸭肉的剪切力降到了24.451 N，显着低于5 min和10 min（P＜0.05），随着嫩化时间的延长，超声波对酶活力的影响增加，酶的活力显着下降，酶对鸭肉中蛋白的水解达到了饱和。
pH值对鸭肉嫩化效果的影响
pH值对鸭肉的嫩化效果影响显着（P＜0.05）。菠萝蛋白酶的最适作用pH值在5～8之间，pH值为7时嫩化效果最好，这与前人报道的pH值在7.1附近菠萝蛋白酶活力达到最高点一致。因此，最佳作用pH值为7.0。
酶添加量对鸭肉嫩化效果的影响
当酶添加量为400 U/g时，鸭肉的剪切力明显下降（P＜0.05），达到了25.211 N，尽管随着酶添加量的增加，剪切力还有轻微下降，但不显着（P＞0.05），当酶添加量达到700 U/g时剪切力虽然显着下降（P＜0.05），但出现了过度嫩化现象，颜色发黄，肉质过软，感观品质下降。因此，最佳酶添加量为400 U/g。
超声波功率对鸭肉剪切力的影响
低功率对肉的嫩度有显着的改善作用，在由60 W增加到80 W时，鸭肉的剪切力显着下降（P＜0.05），这也是由于超声波对肌纤维蛋白产生机械物理破坏作用，同时其空化作用使线粒体、肌质网和溶酶体膜破坏，加快蛋白酶溶液的扩散和渗透，提高嫩化效果。而随着超声波功率的增加，肉的嫩化效果并未有显着的改善。因此，最佳超声波功率为80 W。
响应面优化试验结果
最佳工艺参数确定及验证实验结果
通过软件分析优化结果可见，响应面模型预测的鸭肉剪切力结果存在最小值，为20.208 N，最佳的嫩化工艺参数为温度44.63 ℃、pH 7.2、酶添加量349.27 U/g、超声波功率83.90 W、嫩化时间15 min。按照实际可操作性，将实验条件修正为温度45 ℃、pH 7.2、酶添加量350 U/g、超声波功率80 W、嫩化时间15 min，在此基础上进行验证实验，实际鸭肉剪切力为21.110 N，与预测值接近，证明此预测模型合理可靠。
2、超声波与菠萝蛋白酶协同作用对鸭肉嫩化的作用机理
协同嫩化与对照组理化指标的比较
除色差外，其余指标在嫩化组和对照组间均出现了显着的变化（P＜0.05）。剪切力由未处理时鸭肉的38.16 N下降到嫩化后的21.11 N。本实验中用较高pH值（7.2）的磷酸缓冲液溶解酶并处理鸭肉，增加肉的pH值（鸭肉本身pH 6.23），同时也是肌肉蛋白水解所致。而pH值的增加会使肌内蛋白分子表面带有更多的净负电荷，从而使肌肉蛋白分子结合更多的水分子。
超声波协同嫩化与单一菠萝蛋白酶嫩化的比较
利用单一菠萝蛋白酶对鸭肉进行嫩化，通过最佳工艺参数获得的最低剪切力为25.14 N，显着高于超声波与酶的协同作用的21.11 N（P＜0.05）。超声波协同嫩化时间远远低于单一菠萝蛋白酶所需要的60 min（P＜0.05）。在2 种嫩化方法的嫩化温度没有显着性差别的基础上，协同嫩化方法所需要的酶量显着少于单一嫩化方法（P＜0.05）。推测是因为超声波提高了菠萝蛋白酶的活性。
SDS-PAGE结果
与对照组相比，超声波与酶协同嫩化鸭肉组的大分子条带几乎完全消失，而分子质量为14.3 ku附近的条带明显加深变粗，说明大分子蛋白被水解成小分子多肽或氨基酸，而此种降解主要由肌球蛋白和肌动蛋白构成的肌原纤维蛋白发生了明显的降解所致。蛋白质水解表明肌原纤维结构的降解以及剪切力的下降，从而肉的嫩度得以改善。
透射电镜结果
对照组样品肌原纤维的肌节完整，Z线平滑，I带和A带清晰可见；嫩化组的鸭肉肌原纤维Z线断裂弥散，肌节松弛变形缩短，I带和A带变得模糊，肌原纤维结构被破坏，嫩化组中可发现肌原纤维小片化现象。有研究用扫描电镜观察菠萝蛋白酶处理的牛肉发现，肌原纤维和肌节都发生了收缩变短现象，牛肉嫩度得到了极大改善。
结 论
采用Box-Behnken设计优化了超声波辅助菠萝蛋白酶嫩化鸭肉的最佳嫩化工艺参数为处理温度44.63 ℃、pH 7.2、菠萝蛋白酶添加量349.27 U/g、超声波功率83.90 W、嫩化时间15 min。数据采用逐步回归拟合，得到剪切力对温度（A）、pH值（B）、菠萝蛋白酶添加量（C）和超声波功率（D）的模型，按实际可操作性，将条件修正为处理温度45 ℃、pH 7.2、菠萝蛋白酶添加量350 U/g、超声波功率80 W、嫩化时间15 min，预测值为20.208 N，实测值为21.110 N。各因素的影响大小为酶添加量＞温度＞超声波功率＞pH值。
相对于未处理的鸭肉，嫩化组鸭肉的pH值、持水力和MFI显着增加，剪切力、肌原纤维溶解度和不溶性胶原蛋白的相对含量显着下降，而色差无明显变化。SDSPAGE图谱显示嫩化组鸭肉中大分子蛋白被水解成小分子，透射电镜显示嫩化组鸭肉肌原纤维Z线断裂溶解，肌节变形，出现了肌原纤维小片化现象。本实验说明超声波与菠萝蛋白酶协同作用对鸭肉的嫩化具有显着的效果，大大缩短了嫩化时间，使鸭肉更加多汁并富有弹性，鸭肉的品质得到了极大的改善。
