东北农业大学食品学院王立敏、马文君、孙红波等人以不同酶解时间（1、2、3 h）、酶添加量（1%、2%）生物解离大豆乳状液为研究对象。从乳状液中蛋白水解度、显微观察、Zeta电位、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及乳状液与对应酶解条件下大豆分离蛋白（SPI）之间内源性荧光变化对乳状液结构及分子间相互作用进行探究，明确生物解离大豆乳状液结构与稳定性之间的构效关系，以期开发新型高效破乳技术，创新升级大豆生物解离技术提供理论依据及应用指导。
1、乳状液中蛋白质水解度分析
两个酶添加量条件下前30 min蛋白质水解度显着升高，这时经酶处理降解后的短肽由于肽键的暴露更易为酶作用，反应体系中含有较少的短肽和较多大分子蛋白质，而这部分蛋白质依然有一定的乳化能力。水解度在60 min以后增加趋缓，这种现象符合酶解过程的一般规律，随着时间延长，酶解反应速率逐渐变小，这时乳状液中蛋白质经水解后分子质量显着变小，某些极小的多肽分子不足以提供双亲集团，降低了界面吸附蛋白的活性导致油脂与蛋白之间的亲和力降低，被蛋白包裹的乳滴出现聚集。
2、乳状液显微结构观察结果
图1a、b乳滴数量多而小分布密集，乳状液的稳定性较好，图1e、f乳滴粒径较大且分布不均匀，出现了不规则乳滴聚集。这是由于乳状液是一个动态体系，在生物解离过程中乳状液中的乳滴在频繁地相互碰撞，解离时间越长，界面膜更易破裂造成液滴聚并；另外，在一定范围内随着酶解时间的延长和酶添加量的增加，乳状液中水解度逐渐增加，使暴露的疏水基团重新通过疏水相互作用在蛋白结构内部形成更大的聚集体导致乳状液中蛋白质残基上疏水位点较少。
3、Zeta电位分析
本实验生物解离得到的O/W型乳状液样品Zeta电位均表现为负值，与前人的研究相符。酶添加量一定的条件下，酶解时间越长Zeta电位绝对值越小，这主要由于随着酶解时间延长，包裹在油滴表面的蛋白膜被酶解成低分子质量肽段从油滴表面脱落，减少乳状液界面膜的电荷密度，降低了乳滴之间排斥力，导致乳滴的聚集。
4、SDS-PAGE测定结果
随着酶解时间延长，乳状液中蛋白亚基的条带越来越浅，说明蛋白被酶解成分子质量较小的肽段，尤其酶解2、3 h时乳状液中肽段的分子质量小于20 kDa，这些结果与前人的研究结果一致。由于分子质量较小的肽段缺乏大豆蛋白完整的二级、三级结构，不足以提供空间阻碍和稳定界面膜的作用，导致乳状液的聚结，这与显微观察的结果一致。
5、荧光光谱分析
SPI随着酶解时间延长，λmax发生红移，荧光强度逐渐增强，这是酶解处理使蛋白球形结构变得松散伸展，深埋在球状结构内部的色氨酸残基暴露导致。另外发现，相对于对应酶解时间下SPI，乳状液中蛋白色氨酸残基荧光强度明显减弱，在乳液中色氨酸残基可能与疏水性油相接触，导致色氨酸残基的微环境发生变化，也暗示着乳状液中蛋白质分子构象发生改变。
结 论
本实验在前人对生物解离提油工艺参数研究基础上，选用不同酶解时间（1、2、3 h）、酶添加量（1%、2%）条件下得到的生物解离大豆乳状液体系，从宏观到微观逐步探究了乳状液的结构特征及分子间相互作用，得到主要结论如下：1）本实验得出生物解离乳状液中蛋白水解度在7%左右；随着酶解的进行，吸附在乳状液界面上的蛋白质被酶解为分子质量较小的肽段，降低了界面吸附蛋白的活性导致油脂与蛋白之间的亲和力降低，被蛋白包裹的油脂滴出现絮凝；另外随着乳状液中水解度逐渐增加，暴露的疏水基团通过疏水相互作用重新形成更大的聚集体导致乳液中蛋白质残基上疏水位点较少，影响了乳液中油脂与蛋白结合，也促使乳滴出现聚集；同时由于分子质量较小的肽从油滴表面脱落，导致界面膜的电荷密度减少，Zeta电位绝对值减小。2）SDS-PAGE观察到条带上方出现了大分子质量的蛋白，这些蛋白聚集体可能是由二硫键引起的，二硫键引起的蛋白聚集体验证了荧光分析中乳状液中色氨酸的荧光强度减弱现象。同时乳液中蛋白聚集体的形成使乳液中蛋白质残基上疏水位点较少，导致脂质与蛋白结合的程度降低，乳滴出现聚集这也与上述显微观察解释结果一致。3）荧光光谱结果发现：SPI随着酶解时间延长，λmax发生红移，荧光强度逐渐增强；相对于对应酶解时间下SPI，乳状液中蛋白色氨酸残基荧光强度明显减弱，推测出现此现象是磷脂的存在、蛋白-油脂之间的相互作用及蛋白质聚集体导致。
本实验从分子间相互作用方面探讨了生物解离大豆乳状液结构特征，尤其是油脂与蛋白亲和力、蛋白与蛋白之间形成的聚集体等分子间相互作用对乳状液结构及稳定性的影响。乳状液中磷脂、多糖等小分子间相互作用对乳状液稳定性影响机制尚未清楚。由于乳状液中这些小分子含量较少直接分析较为困难，因此从合成乳状液方面探讨乳状液中磷脂、多糖等小分子间相互作用对乳状液稳定性影响机制有待下一步研究。
