为大规模制备茶黄素-3,3’-双没食子酸酯（TFDG）单体，南京农业大学食品科技学院吴光亮、刘新涛、胡 冰等人利用单因素试验和响应面法中的Box-Behnken设计优化TFDG合成底物EGCG/ECG物质的量比、pH值和温度等反应条件，并利用AB-8层析柱结合HSCCC从酶促反应液中纯化TFDG单体。
1、生成TFDG的HPLC检测结果
梨PPO可以催化EGCG和ECG合成TFDG，经过60 min的反应，大部分表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）转化为TFDG，这说明梨PPO具有较好的合成TFDG能力。因此，本研究以TFDG产率高低作为评价标准，探讨PPO催化EGCG和ECG合成TFDG的最适EGCG/ECG物质的量比、pH值和反应温度。
2、单因素试验结果
EGCG/ECG物质的量比对合成TFDG的影响
结果可知，以EGCG和ECG作为底物合成TFDG时，EGCG和ECG的物质的量比对TFDG产率影响较大。EGCG/ECG物质的量比为1∶1时，EGCG产生的醌不足以和ECG产生的醌相结合，TFDG的产率为54.1%；但是EGCG/ECG物质的量比为3∶1时，EGCG产生的醌足以和ECG产生的醌相结合，TFDG的产率可大幅度提高到77.3%，随着底物物质的量比例的升高，TFDG的产率并未明显提高。为节约儿茶素同时保证TFDG产率，设定EGCG/ECG物质的量比为3∶1作为响应面试验的中心点。
反应pH值对合成TFDG的影响
当pH值为3.0时，酶活力在该pH值条件下比较低，导致TFDG的产率仅为22.7%；pH值在4.0～5.5范围时，TFDG产率为80%～87%；当pH值升高到6.0～7.0时，TFDG产率急剧下降至35.5%，推测pH值升高使得PPO活力下降，且TFDG在碱性条件下不稳定。根据单因素试验结果，选取pH 4.0作为响应面试验的中心点。
反应温度对合成TFDG的影响
温度升高到35 ℃，TFDG的产率随着温度的升高而增加，在35 ℃左右TFDG产率达到峰值，随后开始下降。由此，选择35 ℃作为响应面试验的中心点。
3、响应面试验结果与分析
通过软件分析确定PPO催化合成TFDG的最佳条件为EGCG/ECG物质的量比为3.08∶1、pH 4.10、温度36.96 ℃，在此条件下计算得出的TFDG产率理论值为84.63%。为方便实验进行选取EGCG/ECG物质的量比3.1∶1、pH 4.10、温度37 ℃进行验证实验，得到TFDG产率为（85.14±0.40）%，实验值与预测值一致性较好。说明该多元二次回归方程可靠性较好，适合对TFDG产率的预测。
4、TFDG单体的纯化结果
经HPLC分析2号和3号峰分别为EGCG和ECG，4号峰为TFDG，TFDG的纯度可达到97%，说明该方法能够高效地从TFDG的粗提物中纯化出高纯度的TFDG单体。
结 论
通过单因素试验探讨了物质的量比（EGCG/ECG）、pH值和反应温度对皇冠梨PPO催化EGCG和ECG合成TFDG的影响，利用Box-Behnken试验优化得出最佳底物物质的量比（EGCG/ECG）3.1∶1、pH 4.1、反应温度37 ℃；利用AB-8层析柱结合HSCCC对最优反应条件下合成的TFDG反应液进行纯化，TFDG产率和纯度分别能达到85.14%和97%；实验表明该方法对TF1、TF2A和TF2B的制备同样适用，因此本研究为高效率制备各茶黄素单体提供了参考依据。
