随机扩增多态性DNA（RAPD）采用一条随机引物进行基因扩增，可用于较大样本量的初步分型，但无法得到分离株之间的基因进化关系。多位点序列分型（MLST）是一种基于7个管家基因的分子分型技术，其采用双向测序以得到精确、分辨率较高的结果，运用非加权平均数（UPGMA）、基于相关序列（BURST）等算法对结果进行分型分析，且建有实现数据全球共享的平台——MLST国际数据库（PubMLSTDatabase）。该数据库涵盖了B.cereus、金黄色葡萄链球菌（Staphylococcusaureus）、白色念珠菌（Candidaalbicans）等108种微生物以及噬菌体、质粒的MLST方案，其中B.cereus的PubMLSTDatabase建立于2004年，实现了不同国家、不同地区、不同实验室实验结果的比对和溯源性分析，使得临床和食源性分离株的遗传多样性得到广泛研究。西北农林科技大学食品科学与工程学院刘阳、葛武鹏、张静等人对经RAPD初步分型得到的42株B.cereus进行MLST分型分析，探究出婴幼儿配方羊乳粉加工生产环节得到的分离株的基因多样性和系统进化关系，为其溯源和有效防控提供了参考。
1、管家基因PCR结果
不同管家基因的特异性引物进行PCR反应后的产物凝胶成像如图1所示，特异性引物均能扩增出单一清晰的目标条带。
2、MLST分型结果
共7个ST型，分别为ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351、ST-1084、ST-1000和ST-770，其MLSTCC有142、205和23三种。4个成品粉分离株的基因型为ST-1084，其余2个为ST-1000。与此同时，本实验所用的原料羊乳样品经分离鉴定后，发现其污染率为0%（0/15），因此可排除原料羊乳是婴幼儿配方羊乳粉污染B.cereus源头的可能。
3、MLSTCC分析结果
将本研究得到的ST-770、ST-1000、ST-1084、ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351与其CCST-142、ST-23运用数据库在线BURST（n-4）工具分为3组（Group）和3个独体，ST-23和ST-1348同属Group1，ST-142、ST-1000同属Group2，ST-770、ST-1084、ST-205同属Group3，独体ST-1349和独体ST-1350分别是上粉器内壁分离株3L33和土壤分离株3L47的基因型，独体ST-1351是纯羊奶粉分离株1Y55、乳糖粉分离株1Y58、辅料室地面分离株5L45的基因型。BURST的结果与最小生成树的结果一致，相互验证分离株的亲缘进化关系。
4、不同来源分离株ST型比对分析
我国已上传至PubMLST Database的B. cereus分离株共153 个，与之对应的基因型有126 个，其中包括本研究得到的ST-1348（分离株3L4）、ST-1349（分离株3L33）、ST-1350（分离株3L47）、ST-1351（分离株1Y55、5L45、1Y58）4 个基因型，使用n-4的BURST将我国不同来源B. cereus分离株的ST型分为10 个组和12 个独株。
用BURST（n-4）比对了全世界B. cereus分离株，得到27 个组和33 个独株，进一步分析本研究所得的所有基因型的同源关系。ST-1000、ST-1084、ST-770、ST-1351同属以ST-142为祖先克隆Group 1，其中ST-1084从属以ST-205为首的亚克隆复合物；ST-1348从属以ST-56为祖先克隆的Group 4；ST-1349与ST-57、ST-76同属Group 7。
结 论
婴幼儿配方羊乳粉生产环节的B. cereus分离株共分为7 个ST型，分别为ST-770（4.8%，2/42）、ST-1000（71.4%，30/42）、ST-1084（9.5%，4/42）、ST-1348（2.4%，1/42）、ST-1349（2.4%，1/42）、ST-1350（2.4%，1/42）和ST-1351（7.1%，3/42），其中ST-1000是婴幼儿配方羊乳粉生产环节分离株的主要ST型；发现了4 个新的ST型和4 个新的等位基因，上传至PubMLSTDatabase得到新的序列号和等位基因号，分别是ST1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351和glp-253、glp-254、ilv-277、pyc-199。婴幼儿配方羊乳粉生产环节B. cereus分离株的基因具有多样性；婴幼儿配方羊乳粉生产环节分离株的ST型被识别为205、142、23三个不同克隆谱系，2 个单态群（ST-770和ST-1351）和2 个独株（ST-1348和ST-1349），其祖先克隆复合物为142，没有得到典型致呕吐基因型ST-26或其同源克隆复合物，而可能引起菌血症的基因型ST-1348在浓缩车间的空气样中检出。新的ST-1349、ST-1350无祖先克隆复合物，表现出进化变异。
