来自中国检验检疫科学研究院的邢冉冉、吴亚君和陈 颖介绍了宏条形码的含义和研究方法，综述了近年来宏条形码技术在食品物种鉴定领域的应用，总结和讨论了宏条形码技术应用于食品物种鉴定领域面临的挑战，并对该技术的发展方向进行了展望。
1. 宏条形码技术概述
1.1 DNA条形码技术
DNA条形码技术是利用基因组中一段标准的、相对较短的DNA片段作为物种标记，通过进化树分析来描述物种间的亲缘关系，进而对物种进行鉴定的一项技术。
与传统的分类手段相比，DNA条形码技术具有以下优点：1）不受个体发育阶段和基因片段的限制，甚至对已降解的样品也可以进行分析；2）加快了对已知物种的识别速度，同时便于发现新物种；3）加速了便携式手持设备的研发，可以尽快实现现场完成样品的处理、扩增、测序和鉴定；4）为生物的分类提供了条件。然而，在显现优势的同时，基于Sanger测序法的DNA条形码技术的局限性也非常明显，其中一点就是无法同时完成对多个体多物种混合样品的高效快速分类及评估。
1.2 基于高通量测序的宏条形码技术
宏条形码技术就是近年来随着高通量测序技术的发展而出现的一种新型物种鉴定技术。这种技术结合了DNA条形码技术和高通量测序技术的共同优点，可以获得来自于混合样本中所有目标DNA片段的序列，然后将这些序列与合适的数据库进行比对即可确定其代表的物种，从而可以分析混合样本中的物种组成。
宏条形码技术最突出的优点就是可以更加快速、准确地对混合样本或环境样本中所包含的生物体进行鉴定，能够实现同时检测复杂样品中多个物种的目的。其优点主要包括：1）测序对象为短的PCR扩增子，有利于对降解和低分子质量的DNA样品进行分析；2）采用通用的PCR引物，因此可以对未知物种进行分析；3）经济，同时对大量样本分析降低了每个样本的成本；4）深度测序，增加了检出微量DNA的可能性。这些优点对于食品类型鉴定，特别是对于未知食品、复杂食品或者深加工食品来说有着非常重要的作用，为分析食品中的物种成分提供了一个新的研究手段。
2. 宏条形码技术在食品物种鉴定中的应用
2.1 动物源性食品
不同肉类、禽类品种之间的价格差异很大，因此肉类产品的掺假主要是品种掺假。针对动物源性食品掺假现象，宏条形码技术的主要应用对象是混合肉制品，这也体现了宏条形码技术在混合样品物种鉴定方面的优势。
DNA条形码技术已经广泛地应用于鱼类产品的分类和鉴定，绝大多数常见的鱼类都可以用DNA条形码技术进行鉴定。高通量测序技术的出现则进一步推动了DNA条形码技术在水产业中的应用。
2.2 植物源性食品
随着国际贸易的发展和经济的全球化，市场上的农产品和植物源性食品来源越来越广泛，种类也越来越多，对这类食品进行真伪鉴别和产地溯源就变得愈加困难。在欧盟，针对相关问题，已有相应的规定开始颁布并实施，例如食品中所含物种成分（包括过敏原）的正确标识，橄榄油、葡萄酒和面食的掺假鉴定以及可可和咖啡的合法贸易界定等。相比传统的食品真伪鉴别方法，宏条形码技术作为一种基于高通量测序技术而发展起来的新的物种鉴定技术，在目前植物源性食品的鉴定工作中应用并不广泛，但是已经显现出很大的优势，例如在混合植物源食品、加工食品的物种鉴定方面都将具有更大的应用空间。
2.3 复杂食品和深加工食品
对于复杂食品的真伪鉴别，从本质上可以追溯为鉴定其生物成分。当食品是多品种混合物时，其成分复杂且含量不一致。利用宏条形码技术对复杂食品的成分进行鉴定时，可以非特异性地将所有主要物种及杂质物种都检测出来，在生物混合体系研究方面具有更大的优势。
在深加工食品的鉴定中，宏条形码技术也已得到初步应用。Mu?oz-Colmenero等利用PGM测序平台对不同类型糖果中所包含的动物物种成分进行了分析，以16S核糖体基因作为分子标记，并将分析结果与常规的DNA条形码技术进行比较；研究结果显示：绝大多数利用PGM测序平台进行测序分析的结果与利用DNA条形码技术进行物种检测的结果一致；而基于PGM测序平台的高通量测序技术能够从糖果样品中检测到更多的动物物种，并且检测的灵敏度更高；但是，利用PGM测序平台获得的物种序列中含有更高的碱基对AT含量。除此之外，该研究还指出利用高通量测序技术在分析复杂度相对较低的食品方面具有更大的优势，但在对高度加工的食品进行物种鉴别和追溯的应用方面尚不成熟。
3. 宏条形码技术面临的挑战
3.1 条形码选择的局限性
高通量测序技术的测序读长普遍较短（ 长度为35～700 bp），而这可能是此技术在物种鉴定的应用方面存在的一个比较大的限制因素。每个测序平台都有其优劣，因此，在应用宏条形码技术进行物种鉴定时，除了要考虑条形码的分辨率和引物的通用性等问题，还需要根据测序仪的测序长度来选择合适的条形码长度
在物种信息的确定方面，宏条形码技术与传统的DNA条形码技术相同，得到的未知靶标都必须要与参考数据库中已被鉴定的靶标进行比对才能获知物种信息；因此在利用宏条形码技术时，参考数据库的不完善成了一个很大的受限因素。具体到宏条形码技术在食品中的应用，其局限性还包括：1）加工食品中的DNA通常是高度降解的，一些较长的基因长片段可能并不能完全准确地扩增出来；2）在一些复杂食品中，由于多个物种需要在同一个PCR管中扩增目的条带，这就要求所用的引物必须具有高度通用性，也就是说在各物种间扩增效率要一致。
3.2 定量的局限性
定量问题是目前在应用宏条形码技术进行物种鉴定时存在的一个相对难以解决的问题，这是由于在此技术的应用过程中，存在PCR偏差、基因的多拷贝性以及实验流程的不同等问题，这会导致测得序列的数量与实际样品中的物种数量并没有很强的相关性；因此难以利用该技术对样品中的物种成分进行定量分析。目前普遍认为定量困难主要是由PCR过程中引物和模板错配以及纯粹的随机效应而造成的。在利用宏条形码技术时，需要设计特异性探针，然后与基因组DNA进行杂交，经过PCR扩增后得到基因组目标区域的DNA片段；这个过程造成了该方法存在一个较大的缺陷，即PCR过程会产生偏差。
目前，针对宏条形码技术实验过程中出现的偏差因素进行改善的措施主要集中在改变单个物种产生的偏差，或者是改善实验步骤方面。最近也有一些研究针对偏差的修正问题进行了探讨，认为不同物种间模板DNA的拷贝数或者DNA的浓度不同可能造成一些物种过量扩增，而另外一些物种扩增量较低的现象。通过修正拷贝数和优化实验方法可以在一定程度上提高宏条形码技术对于物种定量的能力；此外，还可以通过设置对照组来修正单个样品在实验过程中产生的偏差。但是，除此之外还存在其他的技术因鉴于以上方法都无法完全解决利用高通量测序技术对食品中的物种成分进行定量分析的问题，一些研究也在尝试利用全基因组测序的方法来解决这一难题。素阻碍了研究人员利用测定序列数的比例来判断样品中各物种的量或者比例。
而且到目前为止，全基因组测序的成本仍然很高，且参考基因组的数量有限。因此，对复杂食品中的所有未知物种成分进行全基因组测序，不管是从成本还是数据分析方面来说，都有很大的挑战。
