1.1 实验材料
2015年9月，分别于云南省昆明市嵩明县阿子营村(T1?T4)和楚雄彝族自治州禄丰县(T5?T8)随机采集新鲜干巴菌子实体共8个。
1.2 培养基、主要试剂和仪器
细菌菌株分离与培养使用胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)，真菌菌株分离与培养使用马丁培养基，各培养基配方参照《微生物学实验》。上述培养基于1×105Pa灭菌30min后备用。溶菌酶、引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；Taq酶，大连宝生物工程有限公司；无机试剂，昆明仁科商贸有限公司。高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；PCR仪，杭州博日科技有限公司。
1.3 干巴菌子实体内微生物的分离与培养
选择新鲜、幼嫩、无扇状分支或少分支的干巴菌子实体，清除表面泥土和松针，用75%的酒精表面消毒。在超净台中徒手掰开子实体，用无菌手术刀切取0.5g 的菌肉放入装有4.5mL 灭菌生理液(0.85%氯化钠)的离心管中，用高通量组织研磨器(60Hz，1 800r/min)将菌肉破碎至无成型组织块，并将组织液于37 °C、120r/min 培养30min。超净台内将组织液分别稀释至 10?2?10?6g/mL。吸取50μL10?4、10?5、10?6g/mL 浓度的组织液分别均匀涂于 TSA 培养基上，每个浓度3个重复，并于28°C进行培养。10?2、10?3、10?4g/mL 浓度的组织液涂于马丁培养基上，每个浓度3个重复，并于26°C下进行培养。2?7d后，对不同培养基内的微生物进行单菌落计数，将单菌落挑取接种至装有液体TSA培养基和马丁培养基的离心管中进行培养。
1.4 可培养微生物的分子鉴定
1.4.1 细菌DNA提取与扩增
5000 r/min 离心10min，弃上清液，加入TESbuffer (20mmol/LTris，50mmol/LEDTA，150mmol/LNaCl，pH7.9)，13000r/min 离心2min；再加入1.2mL TES buffer重悬；加入300μL溶菌酶(5mg/mL)裂解细胞，并将其置于37 °C 下60 min。16S rRNA基因扩增引物为63f (5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和 1495r (5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)；25μL PCR 体系：DNA1 μL，正、反向引物(5μmol/L)各1 μL，10×Buffer (Mg2+ free) 2 μL，dNTPs (10 μmol/L) 1 μL，BSA (1%) 0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL，5 U/μL Taq 酶 0.3 μL，ddH2O16.7 μL。PCR 反应条件：95 °C 5 min；94 °C 1 min，60 °C 1 min，72 °C 1 min，27 个循环；72 °C 10 min。
1.4.2 真菌DNA 提取与扩增
CTAB法提取真菌DNA。扩增引物为ITS1F(5′-GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。25μLPCR 反应体系：DNA1μL，正、反向引物(5 μmol/L)各1μL，10×Buffer (Mg 2+)2.5μL，dNTPs(10μmol/L)1.5μL，BSA (1%)1μL，MgCl2(25 mmol/L)0.5μL，Taq 酶(5 U/μL) 0.3 μL，ddH2O16.2μL。PCR 条件：95 °C5min；94 °C1min，50 °C 1min，72 °C1min，35个循环；72 °C10min。
1.5 数据分析
使用BLAST对获得的序列与GenBank中的序列进行比对，相似度大于98%的作为一个OTU。使用ContigExpress 拼接与编辑序列，在BioEditv7.0.9 中进行比对和自动排序，排好的序列用MEGA 6.0中的Neighbor-Joining 构建系统发育树。干巴菌8个子实体内微生物群落数量用SPSS13.0 进行独立样本t 检验(t-test)。
