1 方法验证和确认的不同概念
1) 方法验证的对象:在ISO/IEC 17025:2017《检测和校准实验室能力通用要求》条款中规定“在引入检测或校准之前, 实验室应证实能够正确地运用这些标准方法”, 在英文标准的这一条款中采用了“verification”一词, 英文可译为“证实”或“验证”。标准方法是指由公认机构经过评价确认后向社会公开发布的技术规范文件。ISO/IEC 17025:2017这一条款的规定就意味着实验室在使用标准方法之前, 应经过方法验证, 或称之为方法证实, 即实验室在使用标准方法进行检测前需要证实实验室使用标准方法的技术能力是否达到了标准的规定要求。
2) 方法确认的对象:在ISO/IEC 17025:2017《检测和校准实验室能力通用要求》条款中规定“实验室应对非标准方法、实验室设计 (制定) 的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法进行确认, 以证实该方法适用于预期的用途”, 上述这四种方法均属于非标方法, 因为这四类方法都是未通过公认机构的评价确认并向社会公开发表、仅只由实验室人员做了评价而使用的方法。ISO/IEC 17025标准英文中对确认采用了“veridition”一词, 该条款的规定意味着实验室在使用非标准方法、实验室设计 (制定) 的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法之前, 应经过方法确认, 即实验室需要确认实验室所使用的非标准方法、实验室设计 (制定) 的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法所获得的检测结果具有科学性、准确性和有效性。例如, 当需要检测全毛织物中某项成分指标时缺少检测标准, 实验室因而采用了化纤织物中该项成分指标检测标准, 这样就是使用了超出其预定范围使用的标准方法来检测, 实验室就应通过试验证明采用化纤织物中该成分指标检测标准可以用于全毛织物的检测, 所获得的检测结果仍然是准确和有效的。又如, 元素检测标准方法规定的检测设备是原子吸收分光光度计, 测定过程中分析每项元素需要使用不同的空心阴极灯, 但实验室在检测某一样本时需要同时测定多种元素, 因此希望使用等离子耦合发射光谱仪替代原子吸收分光光度计, 以达到一次性检测多元素, 提高检测速度的目的, 因为出现了对原标准方法中的设备替换, 则实验室应确认这样的设备替代所获得到的检测结果是准确的, 因此实验室通过两种不同设备对同一样本进行测试, 并对所获得的检测结果数列进行t检验评估, 证明二种方法获得的检测数据不存在显着性差异, 进而确认设备替换的结果是准确有效的。从以上的实例看, 都需要实验室通过技术手段来确认对原标准的扩充或修改的技术路线是科学的, 所获得的检测结果是准确的和有效的, 并能满足客户的检测需求。
2 方法验证和确认的步骤
2.1 方法验证的步骤
实验室在新检测标准投入使用前进行验证时首先需要对新检测标准的文本进行分析评价, 以评估实验室所拥有的人员、设备、方法、试剂材料和检测环境等资源条件是否满足检测标准要求。当评估结果为上述资源条件能满足检测标准的要求后, 还需要验证实验室是否已经具备准确执行该检测标准的技术能力。对化学检测实验室, 需要通过技术试验, 证实实验室检测人员完成的方法标准曲线、检出限、回收率和精密度等检测技术指标是否已经达到检测标准的要求, 关键的技术指标判定可以参考表1~表3给出的信息。
当投入使用的检测标准发生变更后, 首先要对新标准的文本进行评估。若评估发现新的标准技术路线未发生变化, 而仅仅是标准名称、年号或文本格式等发生变化, 则可以直接通过技术评审, 投入使用, 并及时向实验室认可机构申请标准变更。若文本评价中发现新标准的技术路线与老标准的技术路线不一致, 则需要重新评审实验室所拥有的人员、设备、方法、试剂材料和检测环境等资源条件是否满足检测标准的要求, 还需要重新通过试验相关技术参数证实实验室是否已经具备准确执行该新的检测标准的技术能力。
2.2 方法确认的步骤
实验室当需要使用非标准方法、实验室设计 (制定) 的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法时, 首先应进行实验, 优化确认检测方法的技术路线和各项技术参数, 如果是定量检测还应包括测量不确定度评估。当技术路线和技术参数确定后, 还应通过标准物质、或与经典方法比对、与外部实验室比对等方式完成对非标方法的科学性、准确性和有效性评价, 并依据ISO/IEC 17025:2017的规定完成非标方法的文本编写, 通过技术审批, 在使用前还应该告知客户。在非标方法的技术确认中, 除了方法标准曲线、检出限、回收率、精密度和准确度等技术指标外, 还需要完成方法的特异性、抗干扰性、耐用性试验, 定量检测还需要完成测量不确定度评估。
非标准方法投入使用后如果在技术方面需要改进和完善, 也同样涉及到非标方法的变更。这就需要实验室重新按照新的非标方法确认的步骤完成上述的确认工作, 在新的非标文本中对变更的技术路线及参数做出修正, 并通过技术审核和告知客户。
3 检测方法的验证与确认的参数
化学检测的对象即分析的目标化合物按照性质可以分为不得检出的物质 (禁用物质) 、限制使用的物质 (已制定最高允许残留限量物质) 和无限制使用物质这三类。因此, 在对化学检测方法进行验证和确认过程中制订相关技术指标的试验方案及结果评价时, 也应充分考虑这三类物质的不同特性来控制执行。国际部分技术组织针对化学检测实验室的方法验证与确认都提出了相关的技术要求, GB/T27404-2008标准等文件也给出方法确认与验证可参考的技术参数。从方法验证与确认参数的科学性和有效性论证角度看, 化学检测方法验证的技术指标可分为方法的校准曲线、回收率、精密度、准确度 (正确度) 试验。而非标方法的确认技术指标除了方法的校准曲线、回收率、精密度、准确度 (正确度) 试验以外, 还需要进行方法的特异性、耐用性和测量不确定度评估等确认。
3.1 方法的校准曲线
实验室应确定检测方法校准曲线的数学方程以及校准曲线的工作范围, 浓度范围尽可能覆盖一个数量级, 至少作5个点 (不包括空白) 。对于筛选方法 (即指定性方法或半定量方法) , 方法线性回归方程的相关系数不应低于0.98, 对于确证方法 (即能准确定量的方法) , 方法线性回归方程的相关系数不应低于0.99。测试溶液中被测组分浓度必须在校准曲线的线性范围内。
3.2 方法的回收率
方法的回收率代表了测试人员操作检测过程所获得测试结果的准确性。考虑到被测物的浓度水平会影响到回收率试验结果的高低, 因此, 在进行方法的回收率验证试验时, 对于禁用物质, 回收率应在方法测定低限 (LOD) 、两倍方法测定低限和十倍方法测定低限进行三水平试验;对已制定最高残留限量MRL的最大化学残留量, 回收率应在方法LOD、MRL、选一合适点进行三水平试验;对于未制定MRL的, 回收率应在方法LOD、常见限量指标、选一合适点进行三水平试验。每一水平做双平行。可参考表1给出的数据进行回收率结果的评价。
表1.回收率可接受范围
3.3 方法的精密度
方法的精密度代表了测试人员操作检测过程所获得测试结果的稳定水平。在进行方法的精密度验证试验时, 对于禁用物质, 精密度试验应在LOD、两倍LOD和十倍LOD三个水平进行;对于已制定MRL的, 精密度试验应在LOD、MRL、选一合适点三个水平进行;对于未制定MRL的, 精密度试验应在LOD、常见限量指标、选一合适点三个水平进行。每一浓度水平的重复测定次数>6。精密度测试的结果可通过实验室内的变异系数 (CV=标准偏差/平均值) 来表达, 标准偏差s可通过贝塞尔Bessel公式计算得到, 并可参考表2给出的数据进行精密度结果的评价。
表2.实验室内变异系数
3.4 方法的准确度
方法的准确度又可称为方法的正确度, 指的是重复分析标准物质 (实物标样) 或水平测试样品, 测定的含量经回收率校正后, 得出测定值与真值的偏差范围。可参考表3给出的数据进行准确度结果的评价。
表3.实验室内变异系数
3.5 方法的特异性
实验室在使用非标方法、实验室设计 (制定) 的方法、超出其预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法时, 有必要对使用方法的特异性进行确认, 因为仅仅基于色谱分析的技术手段不能准确地区分同一分子量的物质 (同分异构体) 。对于能够准确定量检测的方法要保证检测的结果准确性, 避免异构体结果的误判, 因此就应该根据待测物的化学结构信息、使用分子光谱等技术才能满足方法的特异性。方法的特异性确认可采用如下的技术手段:
1) 气相色谱分析结果再用气相色谱质谱分析技术确证;
2) 液相色谱分析结果再用液相色谱质谱分析技术确证;
3) 免疫亲和色谱分析结果再用气相色谱质谱分析技术确证;
4) 气相色谱分析结果再用红外光谱分析技术确证;
5) 液相色谱分析结果再用免疫层析分析技术确证。
3.6 方法的抗干扰性和耐用性
实验室采用的非标方法应具有对测试过程中可影响测试结果因素的抗干扰能力, 当测试条件发生细小变动时, 方法可具有一定的保持测试结果不受影响的耐受程度, 方法的技术条件应满足最大的波动影响, 并且设备、试剂、操作过程等应具有尽可能广泛的适用性和耐用性, 不宜具有严苛的要求。
实验室只有做好方法验证和方法确认, 才能用测试数据真实地证明实验室使用标准方法的操作能力, 证明所使用的非标方法具有的科学性、适用性、准确性和有效性, 达到确保实验室检测结果准确无误的目的。
