来自福州大学生物科学与工程学院的方菲、陈惠敏和汪少芸以鲷鱼鳞为原料，通过酶解制备多肽，使用Xyl与鲷鱼鳞多肽（FSP）进行美拉德反应，并采用荧光光谱等技术对美拉德反应产物的结构进行分析，同时，研究了美拉德反应前后多肽抗氧化活性的变化及对美拉德反应产物PPO活性抑制机制作初步探究，旨在充分利用鱼鳞资源、变废为宝及生产多功能美拉德反应产物，进而提高鱼鳞多肽的附加值。
1.FSP-MRPs优化试验结果
单因素试验结果
随着反应时间的延长，吸光度与DPPH自由基清除活性逐渐上升，在4.0 h后趋近于平缓；而Xyl与FSP质量比对吸光度与DPPH自由基清除活性的影响均呈现先上升后降低的趋势，在Xyl与FSP质量比为1∶1时DPPH自由基清除率最大；随着Xyl与FSP总质量浓度的增加，DPPH自由基清除率与吸光度均增加，在质量浓度90 mg/mL时，趋近于平缓；美拉德反应历程因反应pH值不同有所差异，pH值为11、12时DPPH自由基清除活性与吸光度均大幅度增加，表明较高初始pH值条件有利于美拉德反应的进行；反应温度为90 ℃时吸光度与DPPH自由基清除活性影响急剧上升，100 ℃后趋于平缓，表明高温条件有利于美拉德反应的进行。
响应面优化试验分析
通过回归模型分析预测得FSP-MRPs的制备工艺参数为：反应时间4.05 h、Xyl与FSP质量比1.3∶1、Xyl与FSP总质量浓度77.19 mg/mL、初始pH 11.85，预测的DPPH自由基清除率为88.65%。为实际操作方便将参数调整为反应时间4.05 h、Xyl与FSP质量比1.3∶1、Xyl与FSP总质量浓度78 mg/mL、初始pH 11.85，进行3 次平行实验，得FSP-MRPs的DPPH自由基清除率为（88.55±1.12）%，与预测值接近，证明所建立模型的可靠性及响应面优化对所制备FSP-MRPs的DPPH自由基清除率的预测具有可行性。
2.FSP-MRPs结构分析
荧光光谱分析
FSP、FSP-Xyl在347 nm波长处有荧光强度，而FSP经美拉德反应后347 nm波长处的荧光消失，并伴随着420～430 nm波长处荧光强度的增加。
红外光谱分析
Xyl的红外光谱图在1200～760 cm?1处出现很多振动吸收峰，即所谓的指纹图谱区，这归因于C—C、C—O键的伸缩振动以及C—H键的弯曲振动。与FSP发生美拉德反应后，大部分吸收峰消失，而FSP-MRPs在1200～1050 cm?1处的吸收峰增强，表明FSP与Xyl发生了共价交联。1420～1360 cm?1处为C—N键的伸缩振动吸收峰，1690～1600 cm?1处则为酰胺I带C＝O键的伸缩振动吸收峰，3400 cm?1附近为O—H键的伸缩振动吸收峰，经美拉德反应后吸收峰强度变大。
Tricine-SDS-PAGE过碘酸Schiff碱染色
在泳道I上，明胶大部分堆积在中间胶上，且表现出较深的洋红色条带，这是因为鱼鳞富含胶原蛋白，而胶原蛋白是糖蛋白且分子质量较大，因而其变性形成的明胶可能也含有糖链，且分子质量较大、分布范围较广，因而展现出洋红色条带。泳道II上无条带显示，这可能是由于明胶经酶解后生成了分子质量较小的多肽片段，较快穿过凝胶而不被截留。FSP经美拉德后，在泳道I、IV上展现出了颜色较淡的洋红色条带。此外，FSP经美拉德反应后游离氨基含量由0.87 mmol/L降低到0.41 mmol/L。另外，FSPMRPs接枝度为52.97%，综合表明FSP与Xyl发生了共价交联，生成了糖肽聚合物，分子质量变大。
3.抗氧化分析
FSP的DPPH自由基清除活性较弱，IC50为2.33 mg/mL，经美拉德反应后DPPH自由基清除活性大大提高（P＜0.05），FSP-MRPs的IC50为125.32 μg/mL，即半数抑制活性提高了17.59 倍，表明FSP-MRPs可通过提供氢原子方式与DPPH自由基结合，形成DPPH-H分子，提高DPPH自由基的清除活性。
FSP-MRPs、FSP及FSP-Xyl对ABTS＋·清除均呈剂量依赖性，FSP经美拉德反应后，ABTS＋·清除活性提高（P＜0.05），其IC50由100.69 μg/mL降低至33.53 μg/mL，半数抑制活性为FSP的3.0 倍。此外，FSP经美拉德反应后，羟自由基清除活性增强，其IC50由4.27 mg/mL降到2.41 mg/mL。这些结果表明，美拉德反应可提高FSP的自由基清除能力（P＜0.05），FSP-MRPs具有较强自由基清除活性。还原力作为物质抗氧化能力的评价方法，吸光度越大则抗氧化能力越强，FSP-MRPs的还原力均大于FSP与FSP-Xyl，在1.5 mg/mL时，FSP-MRP还原力吸光度分别为FSP和FSPXyl的5.58、17.71倍。
4.美拉德反应产物PPO抑制活性与机制分析
PPO抑制活性
FSP-MRPs质量浓度为1 mg/mL时，PPO的相对残余活力为41.99%，即表明有58.01%的酶活性受到抑制，而相同质量浓度的FSP对PPO活性的抑制较FSPMRPs低，表明FSP经美拉德反应后，PPO抑制作用增强，IC50为0.54 mg/mL。
苹果切片褐变结果
对照组在0.5 h内发生急剧褐变，但在随后褐变时间内，褐变程度增加缓慢，总体上表现为切片表皮颜色暗黄无光泽。而FSP-MRPs处理组中，苹果切片的色泽保护程度因FSP-MRPs质量浓度不同略有不同，1 mg/mL与3 mg/mL的FSP-MRPs处理组，苹果切片褐变抑制能力较弱，3 h后褐变较明显，但颜色仍优于对照组，FSP-MRPs质量浓度为5 mg/mL和10 mg/mL时，苹果切片保持着一定的亮黄色，褐变程度较微弱，表明FSPMRPs能够延缓苹果褐变。
FSP-MRPs Cu2＋螯合能力分析
随着FSP-MRPs质量浓度增加，Cu2＋螯合能力增强，表明FSP-MRPs具有Cu2＋螯合能力，这可能是因为FSP经美拉德反应后产生的类黑精、还原酮以及杂环化合物具有螯合金属离子的特性。为进一步探究FSPMRPs与Cu2＋的相互作用，采用荧光光谱扫描分析以探究其螯合机制，随着Cu2＋浓度增加，FSP-MRPs荧光强度逐渐降低，从757.625下降到294.926，其中Cu2＋添加量为2 μmol时，荧光强度降低幅度最明显。
螯合位点猜测
在不同浓度的Cu2＋环境中，FSPMRPs的DPPH自由基、羟自由基和还原力降低显着（P＜0.05）。
结 论
荧光光谱、红外光谱、游离氨基含量以及N-三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳过碘酸Schiff碱染色等结构分析，表明FSP与Xyl经美拉德反应后发生共价交联，肽链结构发生变化且形成了新的化合物；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基、羟自由基以及还原力测定表明，FSP经美拉德反应后抗氧化活性显着增加（P＜0.05）；多酚氧化酶活性测定及苹果褐变实验表明，鲷鱼鳞多肽美拉德反应产物（FSP-MRPs）具有多酚氧化酶抑制活性，其IC50值为0.54 mg/mL，其可能机理为FSP-MRPs具有Cu2＋螯合特性，其螯合位点与抗氧化基团密切相关。
