来自西北农林科技大学食品科学与工程学院的张力、张娟和马凌艳等人选用明胶、壳聚糖作为载体，采用自组装制备丁香酚-明胶-壳聚糖纳米胶囊（Euo-Gel-CS NPs），通过正交试验得到最佳制备工艺条件，采用包封率、缓释效果和纳米表征方法，评价Euo-Gel-CS NPs形态、微观结构和活性成分含量。
1.可溶性明胶-壳聚糖复合物的制备结果
第1阶段：明胶-壳聚糖质量比小于3∶1，溶液体系pH值为6.0，介于壳聚糖解离常数与明胶的等电点之间，壳聚糖和明胶间发生静电作用形成可溶性络合物，明胶在加热时变性凝胶化得到微型纳米尺度凝胶，发生了静电自组装。第2阶段：随明胶-壳聚糖质量比增加，溶液pH值超过静电平衡点，体系形成肉眼可见的不可溶性凝胶颗粒，吸光度与粒径均增大。体系中明胶-壳聚糖质量比为3∶1时，溶液出现淡蓝色乳光且有丁达尔效应，粒径达到最小值为182.34 nm，明胶与壳聚糖产生糖基化反应，体系趋于稳定，为制备可溶性复合物创造最佳条件。
2.单因素试验结果
2.1 壳聚糖质量浓度对粒径及包封率的影响
随着壳聚糖质量浓度的增加，Euo-Gel-CS NPs的粒径以近似直线的趋势上升，各组间均有显着性差异（P＜0.01）。同时包封率呈现先增大后减小的趋势，壳聚糖质量浓度为2 mg/mL时，包封率达到最大值为46.67%（P＜0.01），壳聚糖质量浓度大于2 mg/mL时，随壳聚糖质量浓度增加，体系黏度增大，阻碍了体系内分子自由运动，导致Euo-Gel-CS NPs包封率降低。
2.2 明胶质量浓度对粒径及包封率的影响
当明胶质量浓度较低时，难以满足交联要求，体系Euo-Gel-CS NPs包封率较低，粒径较小；随着明胶质量浓度增加，明胶与丁香酚非共价键相互作用增强，包埋效果明显增加。当明胶质量浓度为2 mg/mL时，包封率达到最大值为46.67%（P＜0.05），明胶质量浓度超过2 mg/mL，颗粒包封率下降，其原因可能为壳聚糖分子与明胶分子链端的—COOH与—NH2基团发生分子间相互作用，占据了有效作用位点，同时粒径增大。明胶质量浓度过高，体系稳定性差，易于析出不溶性物质，Euo-Gel-CS NPs难以形成。
2.3 交联时间对粒径及包封率的影响
交联时间较短时有效交联Euo-Gel-CS NPs难以形成。交联时间最佳值为30 min，体系粒径达到最小值为243.50 nm（P＜0.05），包封率达到最大值为46.67%（P＜0.05），且体系稳定；交联时间延长，明胶与壳聚糖分子黏度降低，颗粒包封率下降，导致颗粒形态不规则、分散度不佳。
2.4 转速对粒径及包封率的影响
转速过低时丁香酚和壳聚糖溶液滴加到明胶溶液后不能立即充分分散，造成混合体系中局部浓度过高，不能发生有效交联。随着转速的增加，基团间交联充分，当转速达到最优值800 r/min时，Euo-Gel-CS NPs粒径达最小值为237.60 nm（P＜0.05），包封率达到最大值为45.53%（P＜0.05）。
2.5 丁香酚质量浓度对粒径及包封率的影响
少量丁香酚分子吸附在明胶分子表面，并未与其形成包附作用，通过高速离心力可以使其小分子分离，导致Euo-Gel-CS NPs包封率较小，丁香酚质量浓度为4 mg/mL时，壳聚糖、明胶、丁香酚分子达到最优配比，包封率为48.02%（P＜0.05），观察体系溶液出现淡蓝色乳光，略有丁香香气，气味柔和不刺激。
3.正交试验结果
3 个因素的影响主次顺序为：明胶质量浓度＞壳聚糖质量浓度＞丁香酚质量浓度。观察正交试验的各加权分数，最优为93.66分，得出制备Euo-Gel-CS NPs的最优组合为A2B2C3，最优制备工艺为壳聚糖质量浓度2 mg/mL、明胶质量浓度2 mg/mL、丁香酚质量浓度5 mg/mL，调节pH值至6.0，转速800 r/min，交联时间30 min，搅拌结束后在60 ℃水浴加热20 min。经验证得Euo-Gel-CS NPs粒径为229.09 nm，包封率达到50.69%。
4.Euo-Gel-CS NPs的表征
4.1 Euo-Gel-CS NPs的粒径大小、分布和形态
最优制备工艺下Euo-Gel-CS NPs的平均粒径为229.09 nm，粒径分布系数为0.251，小于0.3，证明Euo-Gel-CS NPs的分散性良好，可用于后续实验。
Euo-Gel-CS NPs颗粒呈较规则圆形，粒径均匀，形态饱满，粒径约为220 nm，与激光粒度仪测量结果一致。
4.2 红外光谱分析
壳聚糖在1597 cm?1的吸收峰是—NH2的伸缩振动，而Euo-Gel-CS NPs的傅里叶红外光谱在1539 cm?1出现了新峰，说明壳聚糖—NH2与明胶的—COOH相互作用形成了C—N键；丁香酚—OH伸缩振动在3452 cm?1处有吸收峰，Euo-Gel-CS NPs在3500～3300 cm?1内出现一个宽峰，说明纳米胶囊中存在较强的氢键。明胶傅里叶红外光谱图显示了典型的酰胺I和II峰分别在1674 cm?1和1539 cm?1处，酰胺I带的吸收主要是由于C＝O伸缩振动，而酰胺II带由C—N拉伸和C—N—H在平面弯曲两者组成，丁香酚在1423 cm?1处的吸收峰是—OCH中C—O伸缩振动，Euo-Gel-CS NPs的吸收峰在1651 cm?1和1047 cm?1处，表现出向低波数的转移，表明丁香酚和明胶-壳聚糖之间的作用主要由氢键和疏水相互作用组成。
4.3 差示扫描量热分析结果
丁香酚在152 ℃有一个较宽的放热峰；在98、147、173 ℃位置明胶均有吸热峰；壳聚糖吸热峰分别在137、163 ℃出现。明胶-壳聚糖复合物的差示扫描量热分析图显示在59 ℃的吸热峰和在171 ℃的吸热峰，出现吸热峰融合的现象，说明明胶与壳聚糖分子发生静电作用形成了复合凝聚络合物。Euo-Gel-CS NPs仅在较高温度（150 ℃）显示吸热峰，说明三者之间发生强相互作用，促使化学键交联形成结构紧密的纳米颗粒，与红外光谱图结果相符。
4.4 体外释放实验分析
在37 ℃的条件下，Euo-Gel-CS NPs在6 h和8 h后丁香酚释放率分别为34.02%和43.12%，处于初期快速释放阶段。
结 论
制备丁香酚纳米胶囊的最优工艺为壳聚糖质量浓度2 mg/mL、明胶质量浓度2 mg/mL、丁香酚质量浓度5 mg/mL、转速800 r/min、交联时间30 min，该条件下丁香酚纳米胶囊平均粒径为229.09 nm，包封率为50.69%；透射电镜图表明胶囊呈规则圆形，分布均匀；差示扫描量热分析和红外光谱表明丁香酚与明胶以氢键和疏水作用力相互作用；体外释放实验证明丁香酚纳米胶囊具有一定的缓释特性，该制备工艺简便、绿色、温和，可扩大丁香酚使用范围，提高其生物利用度，酚类的纳米包封体系在食品防腐剂方面具有潜在应用前景。
