1.1 菌株
类植物乳杆菌L-ZS9由中国农业大学食品科学与营养工程学院李平兰教授赠送。
1.2 主要试剂和仪器
实验所用普通化学试剂和生化药品，生工生物工程(上海)股份有限公司；RNA提取试剂Trizol，Invitrogen公司；Ribo-Zero rRNA Removal Kit，Illuminia公司；MiniElute PCR Purification试剂盒、QIAquick试剂盒和酶，QIAGEN公司。台式高速冷冻细心机，Sigma公司；2100 Bioanalyzer，Agilent公司。
2 方法
2.1 材料处理
将L. paraplantarum L-ZS9以1%的比例接种到MRS液体培养基中(终浓度为107 CFU/mL)，37 ℃静置培养20 h，然后4 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀备用(试样1)。在45 ℃、6%乙醇(MRS液体培养基中终浓度)、0.10 g/L的NaNO2 (MRS液体培养基中终浓度)条件下分别培养L. paraplantarum L-ZS9，分别收集各个条件下培养20 h菌体，按菌体量1:1:1混合，提取RNA备用(试样2)。
2.2 RNA的提取和文库构建
总RNA提取采用Trizol试剂方法，经过检测符合转录组RNA检测标准(RNA总量≥6 g，OD260/OD280在1.8–2.1范围，rRNA比率23S:18S≥1.5:1)，通过甲醛变性胶检测总RNA的完整性。
样品总RNA用Ribo-Zero rRNA Removal Kit去除rRNA，然后将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，加入缓冲液、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成第二条cDNA链。在经过QIAquick试剂盒纯化后做末端修复。加PolyA并连接测序接头，然后用UNG酶消化第二条cDNA链，连接产物经MiniElute PCR Purification试剂盒纯化后进行PCR扩增，建好测序文库，质检合格后进行测序。
2.3 测序数据分析
测序结果的原始数据(Raw reads)中有些是低质量的，使用Q20 (碱基准确率达到99.9%)的质控标准。使用短Reads比对软件SOAPaligner/soap2将Clean reads分别比对到参考基因组和参考基因序列，并统计出比对结果。
转录本预测。利用Trinity和Velvet软件对过滤后的Clean reads进行从头组装。利用Bowtie 将100 bp能重叠的Reads拼接，拼接形成的片段即为Contig组装片段。利用Paired-end reads确定同一转录本的不同Contig及其距离，将这些Contig连接，获得两端不能延长的序列。挑选出长度大于150 bp且平均覆盖度大于2的转录区域，再从中找出位于基因间区域(一个基因3'端下游200 bp到下一个基因5'端上游200 bp之间的区域)的潜在转录本作为候选的新转录本。
功能注释和ORF预测。将转录本与NCBI中非冗余蛋白数据库(Nr)、去冗余蛋白数据库(SwissProt)、蛋白质直系同源簇、KEGG[19]比对。利用BLASTn将转录本与NCBI非冗余核酸数据库(Nt)比对(E-value cutoffs≤10?5)，得到相似度最高的蛋白信息对其进行注释。
利用InterProScan软件对蛋白功能进行注释，BLAST2GO将注释的蛋白映射到相应的GO (基因本体)中。利用WEGO软件将GO功能进行分类。基因表达量的计算使用RPKM法，参照Audic等基于测序的差异基因检测方法，利用基因与目标基因丰度的比值来判读基因表达升降。
