来自大连民族大学生命科学学院的冯可、胡文忠和姜爱丽等人在建立一共能够同时、快速检测鲜切果蔬中常见病原微生物多重PCR检测方法。对促进鲜切果蔬产业的发展及保障人类生命安全具有重要意义。
1.多重PCR引物浓度优化结果
多重PCR引物浓度优化结果：不同比例的引物浓度扩增的结果有所不同，引物浓度用量较低时，会出现目标条带未被扩增的现象。而当引物用量过高时，会导致单一目标条带过于明亮且弥散。当4 种目标菌的引物浓度配比不同时，易出现杂带扩增的现象。由图1中泳道1～3所示，均有杂带扩增的现象。考虑到条带明亮度的均一性及最大限度的提高扩增效率，则选择泳道7中inv引物浓度为0.4 μmol/L，wzy引物浓度为0.3 μmol/L，inlA引物浓度为0.2 μmol/L，nuc引物浓度为0.4 μmol/L时为最终引物浓度配比进行后续实验。
2.多重PCR体系优化结果
不同比例的反应体系， 如Mg2＋、dNTP、exTaq浓度不同，扩增的结果有所不同。为了最大限度地保障反应过程的扩增效率，选择泳道9中的反应体系Mg2＋浓度为3.0 mmol/L，dNTP浓度为0.25 mmol/L，exTaq酶活力为1.0 U作为反应条件，进行后续实验。
3.多重PCR退火温度优化结果
当退火温度为58.6、59.4、59.8、60.0 ℃时，单核细胞性李斯特菌inlA基因则呈无法扩增的现象，这是由于退火温度过高导致扩增效率显着降低的结果。综合而言，泳道7中4 条目标条带清晰、明亮，因此选择退火温度为56.6 ℃进行后续实验。
4.多重PCR延伸时间优化结果
随着延伸时间的延长，扩增效率呈下降趋势。延伸时间在30～60 s时，均可扩增出清晰条带，考虑到缩短扩增时间，则选择泳道2中延伸时间为30 s进行后续扩增。
5.多重PCR引物间特异性验证
泳道1～6则可效扩增出两两随机组合的目标病原菌，泳道7～10可分别有效扩增出随机组合的3 种目标病原菌，泳道11中含有4 种目标菌。均无非特异性扩增条带出现。阴性对照无扩增条带。
6.多重PCR体系中菌间特异性检测
在同一反应管中可同时扩增得4 种目的基因片段，3 g/100 mL的琼脂糖凝胶电泳显示在285、193、159 bp和121 bp处均有条带出现，且没有引物二聚体形成，没有非特异性条带出现。泳道2～11为非目标菌扩增结果，与对照组一致无条带扩增，表明其特异性良好。
7.多重PCR检出限验证结果
4 种目标菌的检测限分别为单核细胞性李斯特菌为3.5×106 CFU/mL，大肠杆菌O157:H7为4.8×105 CFU/mL，金黄色葡萄球菌为2.4×105 CFU/mL，鼠伤寒沙门菌为1.6×105 CFU/mL。
8.病原微生物预富集多重PCR验证结果
泳道1和泳道4所示，1 CFU/mL接种量在0、3 h富集后无条带扩增，泳道10中，在9 h富集后可有效扩增出4 条特异性条带。103CFU/mL接种后，泳道2所示，0 h无扩增条带，富集3 h后，泳道5所示，均可扩增出4 条目标条带，在106CFU/mL接种0 h后，泳道3所示，可扩增出4 条目标条带。综上所述，结果表明，其实接种量低至1 CFU/mL时，富集9 h后均可扩增出4 条目标条带。
9.人工污染鲜切果蔬样品验证结果
对4 种样品验证均可有效扩增出4 条目标条带，其条带大小与预计大小相符，阴性对照无条带扩增。其中，泳道1～2条带清晰明亮，而泳道3和4中鼠伤寒沙门菌条带较暗，可能是由于鲜切木瓜和鲜切哈密瓜中杂质较多对多重PCR的扩增效率产生了一定的影响。综上所述，鲜切果蔬产品受病原菌侵染后，预富集9 h，利用所建立的多重PCR技术对鲜切果蔬产品的检出限可达到1 CFU/g。
将优化的多重PCR方法对不同接种量富集后验证，结果表明，经过9 h富集后，该方法检出限为1 CFU/mL。该方法在鲜切莴苣、鲜切黄瓜、鲜切木瓜、鲜切哈密瓜中应用同样可扩增出4 条目标菌。因此，利用所建立的多重PCR方法对鲜切果蔬中侵染的病原菌检出限可达到1 CFU/g。该方法相较于传统的培养检测方法具有节约大量的劳力、试剂、时间等优点，检测时间也由原来的5～7 d缩短至9～11 h，对于企业或分析检验中心大批量样品的监测具有指导意义。
