loading buffer的功能主要有两个。
第一,里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用,显示电泳的进程,以便我们适时终止电泳;
第二,里边的成分甘油可以加大样品密度,使样品密度大于TAE,从而沉降到点样孔中,防止样品飘出点样孔。另外,有的Buffer是加有SDS的,一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性,因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液,加loading 100℃加热,也是为了中止酶促反应,防止提取的蛋白质降解。
6×loading buffer 一般配置:
6×Loading buffer: 30mM EDTA
36%(v/v) Glycerol (甘油)
0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF (二甲苯青FF)
0.05%(w/v) Bromophenol BLUE (溴酚蓝)
5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法
组份浓度:
250mM Tris-HCl(pH6.8)
10%(W/V) SDS
0.5%(W/V) BPB
50%(V/V) 甘油
5%(W/V) β-巯基乙醇 配制量: 5mL
配制方法:
1.量取下列试剂,置于10mL塑料离心管中。 1M Tris-HCl 1.25mL SDS 0.5g BPB 25mg 甘油 2.5mL
2.加入去离子水溶解后定容至5mL。
3.小份(500μl/份)分装后,于室温保存。
4.使用前将25μl的2-ME加到每小份中。
5.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。