冷冻食品，如不同种类的肉和肉制品，超市、农贸市场或家庭在不同季节因环境温度不同会自然解冻不同时间。采用不同温度进行解冻不仅对食品品质产生一定影响，对残存微生物的存活也会产生影响，进而对食品安全和货架期产生影响。
因此，来自南京师范大学金陵女子学院的姬赛赛、王娴静和马晶晶等人首先研究E. coliO157:H7不同菌株冷冻后的死亡和损伤情况，进而采用无营养的PBS作为基质研究冷冻后不同自然解冻方式对E. coli O157:H7存活的影响。
1. E.coli O157:H7不同菌株冷冻后菌落数变化
与冷冻前相比，4 株菌冷冻后两种培养基TSA和SMAC上的菌落数均显着下降（P＜0.05），冷冻时间越长，菌落数下降越多，表明冷冻导致细菌发生了死亡和损伤，且冷冻时间越长细菌致死和致伤效果越明显。进一步比较发现，冷冻相同时间时，不同菌株菌落数的下降并不相同，表明冷冻造成细菌死亡和损伤程度存在菌株差异。
4 株菌两种平板上的菌落数差值（损伤菌数量）在不同冷冻时间不尽相同，在冷冻72 h时菌株CICC21530、NCTC12900、两株牛肉分离菌在两种平板上的菌落数差值分别为0.91、0.77、0.23、0.52（lg（CFU/mL））。进一步计算4 株E. coli O157:H7冷冻不同时间于活菌中的损伤率，随着冷冻时间的延长，损伤率逐渐增大，进一步比较不同菌株的损伤率发现，冷冻过程中4 株菌损伤率不尽相同，冷冻72 h时菌株CICC21530的损伤率最高，达到87.70%。值得注意的是，由于选择性培养基SMAC中存在一些抑菌物质，所以冷冻前SMAC上的菌落数稍低于TSA（P＞0.05），即存在一定的损伤率。
2. 冷冻后不同解冻温度对E.coli O157:H7存活的影响
E. coli O157:H7冷冻72 h时产生了较大的损伤和死亡，且存在菌株差异，因此进一步采用混合菌株进行解冻实验，同时为了避免正常菌增殖的干扰，采用无营养的PBS作为基质。4 株菌的PBS混合菌液冷冻前TSA上的初始菌落数为6.48（lg（CFU/mL）），冷冻72 h后菌落数显着下降（P＜0.05）。冷冻后的PBS混合菌液分别置于20、30、37 ℃解冻不同时间， 3 种温度条件下菌落数均继续下降，且解冻温度越高下降越明显，至24 h时3 个解冻温度组TSA菌落数均显着低于冷冻72 h（冷冻后）时菌落数（P＜0.05），且20 ℃、24 h显着高于30 ℃、24 h和37 ℃、24 h菌落数（P＜0.05）。解冻36 h和48 h时，20 ℃和30 ℃菌落数未再出现显着变化（P＞0.05），而37 ℃、36 h菌落数显着增加（P＜0.05），之后无显着性变化；至实验末期48 h时3 个解冻温度组菌落数均显着低于冷冻72 h时菌落数（P＜0.05）。
本实验结果表明，E. coli O157:H7 PBS菌液冷冻后立即置于20、30、37 ℃解冻，细菌发生了进一步的死亡，解冻温度越高死亡越明显。
本实验中37 ℃解冻36 h时菌落数出现增加，可能是解冻初期冷冻损伤严重的菌体采用TSA、37 ℃培养计数时并未得到完全修复生长，至解冻36 h时有更多的修复菌体能够在TSA、37 ℃条件下生长，从而使菌落数出现增加，其具体机制尚需进一步研究。本实验结果表明，冷冻后立即于较高温度下解冻不利于细菌的存活。为了探讨在缓慢解冻时细菌的存活情况，进一步进行冷冻后缓慢解冻方式对E. coli O157:H7存活影响的实验。
3. 冷冻后不同缓慢解冻方式对E.coli O157:H7存活的影响
冷冻前TSA上的初始菌落数为6.33（lg（CFU/mL））。冷冻后于4 ℃解冻0、2、6、12 h再置于37 ℃，与冷冻前相比两种培养基上的菌落数均显着低于冷冻前（P＜0.05），仅除了4 ℃、12 h/37 ℃、5 min组TSA上的菌落数（P＞0.05），表明缓慢解冻仍造成了一定量细菌的死亡/损伤。4 ℃放置一定时间后，置于37 ℃、5 min，37 ℃、10 min，37 ℃、30 min各组两种平板上的菌落数均稍有下降。
进一步对37 ℃、5 min的各组进行比较时发现，4 ℃条件下时间越长菌数越多，4 ℃ 0 h和2 h之间菌落数无显着差异，而4 ℃ 6 h和12 h菌落数显着高于4 ℃ 0 h和2 h（P＜0.05）。37 ℃、10 min各组和37 ℃、30 min各组亦存在相似变化趋势。结果表明4 ℃缓慢解冻时间越长，越有利于细菌的存活。分析原因可能是4 ℃放置较短时间后转入37 ℃时，菌体无法适应温度的突然变化而加重应激损伤程度造成了进一步的死亡，当4 ℃放置较长时间后转入37 ℃时，细菌得到足够时间的缓冲对较高温度耐受增强，也可能在4 ℃较长时间时菌体存在一定程度的修复，具体机制有待进一步研究。
本实验采用4 ℃、12 h/37 ℃、5～30 min解冻，TSA上菌落数无显着差异，SMAC上的亦无显着性差异，而SMAC上的菌落数显着低于TSA上的菌落数（P＜0.05），表明尚有一定量损伤菌存在。
结 论
4 株E. coli O157:H7 -20 ℃冷冻24、48、72 h后均发生了一定程度的死亡和损伤，冷冻时间越长细菌致死和致伤程度越明显，且存在菌株差异，冷冻72 h时菌株CICC21530的损伤率最高，为87.70%。采用混合菌株进行解冻实验，4 株E. coli O157:H7磷酸盐缓冲液菌液冷冻后立即置于20、30、37 ℃解冻，细菌发生了进一步的死亡，解冻温度越高死亡越明显，3 个温度组在解冻48 h时菌落数均显着低于冷冻72 h时菌落数（P＜0.05）。进一步探讨缓慢解冻方式对菌体存活的影响，菌液冷冻后先置于4 ℃一定时间（0、2、6、12 h），再置于37 ℃不同时间（5、10、30 min）观察菌株存活情况，结果表明4 ℃缓慢解冻时间越长，越有利于细菌的存活，4 ℃、12 h/37 ℃、5～30 min解冻方式下改良山梨醇麦康凯琼脂上菌落数仍显着低于胰蛋白胨大豆琼脂上的菌落数（P＜0.05），表明仍有损伤菌的存在。本实验提示采用缓慢解冻反而有利于残存菌的存活，冷冻食品风险评估时应重视残存菌尤其是损伤菌的检测和控制。
