对显色培养基联合简单生化反应鉴定常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌的方案进 行能力验证。
方法
以VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统鉴定细菌作为参考方法，计算联合应 用科玛嘉定位显色培养基、吲哚试验、鸟氨酸脱羧酶试验、赖氨酸脱羧酶试验鉴定临床标本中常见氧 化酶阴性革兰阴性杆菌的敏感度、特异性、似然比、约登指数、Kappa 值等参数并进行
McNemar 检验， 分析这一方案的真实性、与参考方法的一致性并比较经济成本。 结果 通过对8个属 10个种共318株氧化酶阴性革兰阴性杆菌鉴定结果的分析表明，黏质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌的 敏感度和特异性均为 100%，大肠埃希菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌的敏感度和特异性均大于90%，阴沟肠杆菌、产酸克雷伯杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌和奇异变形杆菌的特异性均大于90%，但灵 敏度为75%~90% ；除了弗劳地枸橼酸杆菌的 Kappa 值为0.5947 外，其余均大于0.85；McNemar 检 验 P 值均大于 0.05 ；本研究方案成本只有参考方法的 10%。
结论 显色培养基联合简单生化试验可 快速经济有效地鉴定数种常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌。
临床上鉴定革兰阴性杆菌的主要方案可分为传 统手工鉴定方案和微生物数码鉴定方案。 传统方法需手工配制各培养基和操作，程序繁琐，且需要检验人员有较好的临床工作经验，能够熟记各生化试验 结果对应的细菌种类，随着科技的进步和实验室规 范化要求的提高，传统方法逐渐被半自动、全自动微 生物数码鉴定系统代替，后者操作简便、鉴定范围广、鉴定效果好，但成本高。
自 20 世纪 90 年代以 来，各种显色平板被推荐作为初培养培养基开始出 现在临床微生物实验室 ，且在培养次日可通过菌落的显色反应达到快速鉴定的目的。 许多实验室尝试将其作为一种鉴定方法应用于临床，但对这种鉴定方法的能力尚缺乏科学的评估。
尿道定位显色培养基是目前应用面较广的显色培养基，建议用于尿路感染革兰阴性菌（主要是大肠埃希菌） 的初培养，本研究参考国内外的鉴定方案 ，以血平板为初培养培养基，建立基于尿道定位显色平板，并 结合血平板上的菌落特征和 ３ 个简单生化反应的鉴定方案，对 300 余株革兰阴性菌进行鉴定，并将其结果与VITEK 2 Compact 的鉴定结果进行比较，以对该 方案进行能力验证。
材料和方法菌株来源与鉴定：收集瑞金医院 2011 年11月 至 2012 年12 月分离自门诊和住院患者标本并经氧 化酶试验和 VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系 统（法国梅里埃生物公司）鉴定过的318 株氧化酶阴性革兰阴性杆菌，将其纯培养后转至 30％甘油肉 汤管中于-20℃保存备用。
主要试剂：尿道定位显色培养基；血琼脂培养基；氧化酶试剂、吲哚试剂（生物梅里埃中国有限 公司）；赖氨酸微量生化反应管、鸟氨酸微量生化反应管及氨基酸脱羧酶对照微量生化反应管。
质量控制：以大肠埃希菌ATCC 25922 、产气肠 杆菌 ATCC 13048、阴沟肠杆菌ATCC 700323 、肺炎 克雷伯杆菌 ATCC 13883、产酸克雷伯杆菌 ATCC 700324 、鲍曼不动杆菌 ATCC 19606 、嗜麦芽窄食单 胞菌 ATCC 17666 、奇异变形杆菌ATCC 4630、黏质 沙雷菌ATCC 14756、 弗 劳 地 枸 橼 酸 杆 菌 ATCC 43864 进行质控。
细菌分纯：因显色平板无法覆盖所有可能的病 原菌，所以标本需先接种在弱选择性的培养基上，临 床上最常用的初培养培养基为血琼脂培养基，因此 用无菌接种环从 30％甘油肉汤保菌管中刮取菌液 接种到血平板上，放35℃需氧环境培养18~24ｈ 后 观察菌落形态，同时进行革兰染色以确定为革兰阴 性杆菌。
氧化酶试验：取洁净的一小块滤纸，蘸取菌苔少许，滴加 1 滴10g/L, 盐酸二甲基对苯二胺溶液 于菌落上，观察颜色变化，立即呈粉红色并迅速转化为紫红色为阳性，否则为阴性。
斑点吲哚试验（IND） ：使用 5%（W/V）的对二甲基氨基苯甲醛溶解在 １０％的浓盐酸（W/V）中制成吲哚试剂，用该试剂浸润滤纸片，用无菌接种环从 BAC 上挑取培养18~24ｈ 的菌落在浸润试剂的滤纸上摩擦，20s 内菌落变成粉红色至紫红色为阳 性，黄白色为阴性。
尿道定位显色培养基显色试验：挑取培养 18~24ｈ 的菌落，接种至科玛嘉尿道定位显色培养基， 置孵育箱中35℃培养 18~24ｈ后观察菌落颜色。 每个定位显色培养基分为８区，可同时检测８株细菌。
赖氨酸脱羧酶试验（LDC）和鸟氨酸脱羧酶试 验（ODC）：挑取培养 18~24ｈ的菌落，接种于赖氨酸微量生化反应管、鸟氨酸微量生化反应管及氨基酸脱羧酶对照微量生化反应管，以矿物油封住反应管口以隔绝空气，置孵育箱中35℃培养 18~24ｈ后观察反应管颜色，变紫为阳性，变黄为阴性，对照管应为黄色。
统计学方法：以 VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统鉴定结果作为参考方法，对本研究方案的 正确性和一致性进行评估。 正确性评估通过计算敏感度、特异性、似然比、约登指数等，一致性评估通过计算Kappa值，同时进行McNemar检验评估两种方法对细菌鉴定结果的分布有无统计学差异，检验水 准 α＝０．０５，采用 SAS 8.2 （SAS Institute Inc．， Cary ， NC， USA）进行数据分析。 经 VITEK２Compact 全自动微生物分析系统鉴 定过的 318 株细菌使用本研究方案鉴定的试验结果参照表 1 中的判读标准读取并记录， 其中细菌在定 位显色培养基上的颜色参照枟国际色彩标准名称与 色值枠选择最接近的颜色进行判读。
结果
细菌鉴定：
细菌的鉴定结果按照表1中的标准进行判读，具体结果见表2，显色特点见图1。
表1 试验结果判读标准
Table 1．Interpretation standards for results of the study
注：＋：≥９０％的菌株阳性；Ｖ：10％ ～90 ％的菌株阳性；－：≥90％的菌株阴性；/：非发酵菌，生化反应管未变色，既无阳性结果也无阴性结果
表 2 本研究方案鉴定结果
Table 2．Identification of oxidase-negtive gram-negative bacilli by the designed method， three biochemical tests and reference method
注：ａ 括号中的数字代表细菌数目；＋表示≥90％的菌株阳性； Ｖ 表示10％ ～90％的菌株阳性； －表示≥90％的菌株阴性； ？ 表示无法鉴定为何菌；／表示试验既无阳性结果也无阴性结果
依据在定位显色平板上的呈色特点，实验菌株 大致可以分为 6 类：紫色系的大肠埃希菌；克雷伯杆菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、枸橼酸杆菌属（Citrobacter）的菌落颜色呈蓝色系的暗蓝色、宝蓝色、板岩蓝色，因此可归为克雷伯菌属－肠杆菌属－ 枸橼酸杆菌属组（K-E-C group）；道奇蓝色的黏质沙雷菌；米色并伴有沙棕色晕轮背景的变形杆菌属 （Proteus）；米色系的非发酵菌，其中米色中带有绿宝 石色的为嗜麦芽窄食单胞菌；产色黏质沙雷菌在定 位显色平板上的菌落呈深红色，菌落周边呈道奇蓝色。
2．统计学分析结果：
本研究对所采用鉴定方案 对各种细菌鉴定的相关统计学参数进行计算分析， 由表 3 可以看出，本研究方案对各种常见氧化酶阴 性革 兰 阴 性 杆 菌 鉴 定 的 灵 敏 度 为75.00％ ～ 100.00％，特异性为97.73％ ～100.00％，阳性似然 比为 34.2643 ～∞，阴性似然比为 0.0000～0.2274， 约登指数为 0.7500～1.0000，Kappa 值为 0.5947～1.0000，P 均＞0.05，无 P 值表示本研究方案和参考方法鉴定结果完全一致。
3. 检验成本比较：
将常规方法上机检测与本研 究所用方法的成本进行比较（本部分商品价格仅供 参考）。 一盒定位显色培养基（10个／盒）约人民币 50 元，在不影响检验效率的情况下可接种 ８ 株细菌， 一盒血平板（10 个／盒）约人民币 50 元，在不影响分 纯效率的情况下可接种 ２ 株细菌，加之其他生化试 验试剂耗材每株菌可估计为 ３ 元，显色培养基联合 简单生化试验鉴定常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌的 成本每株菌约 6.125 元，而 Vitek-２ 系统革兰阴性菌 鉴定卡（GN卡）成本每株菌约60 元。
图 1 试验菌株在定位显色平板上的显色特点
Fig 1．Characteristics of colonies plated on CHROMagar orientation medium
注：①大肠埃希菌； ②变形杆菌属；③、④、⑤克雷伯菌属-肠杆菌属-枸橼酸杆菌属组（ K-E-C group） ； ⑥黏质沙雷菌；⑦鲍曼不动杆菌； ⑧-１、⑧-２ 嗜麦芽窄食单胞菌；⑨产色黏质沙雷菌
表 3 定位显色联合生化试验鉴定常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌的统计学参数
Table 3．Diagnostic parameters for the study
文献参考来自：赵声远. 显色培养基联合简单生化试验鉴定常见氧化酶阴性革兰阴性杆菌的能力验证[A]. 中华医学会、浙江省医学会、中华医学会微生物与免疫学分会、全球华人临床微生物与感染症学会、中华医学会微生物与免疫学分会临床微生物学组.中华医学会第十次全国临床微生物学术年会暨第九届全球华人临床微生物与感染症学术论坛暨2013年浙江省医学微生物与免疫学及医学病毒学学术年会论文汇编[C].中华医学会、浙江省医学会、中华医学会微生物与免疫学分会、全球华人临床微生物与感染症学会、中华医学会微生物与免疫学分会临床微生物学组:,2013:3.
