2、最后用毛细管取出100ul出来,加入质粒,混匀!(怕量不够,吸得很多,电转时效果反而不好。 )
3、电转杯清洁处理:一般先冲洗,洗净;然后浸泡在75%的乙醇中;使用前我们都是放在超净台上,开启紫外,边吹风晾干,边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候,电压数以及电击时间可以摸索一下,适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv,放电4.8~5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行,电击时间可以减少一点,设置为5ms左右,电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液,转移至EP管,30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候,在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后,加入1ml的山梨醇,吸入1.5ml的ep管中,置于30度摇床低速培养1h,再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT单独于-20度保存,可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上,按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适,以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。