目前常采用光谱分析技术对蛋白质的空间结构进行表征。来自南昌大学食品科学与技术国家重点实验室的刘珂、熊丽姬和南昌大学食品学院的高金燕等人采用离子层析方法对OVT、OVA和Lys进行分离纯化，并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对分离得到的3 种过敏原以及购买的OVM的纯度和性质进行鉴定，采用不同的加热条件对鸡蛋4 种主要过敏原进行加热处理，并通过CD、UV-Vis光谱、荧光光谱来表征热加工对鸡蛋过敏原结构的影响。
1
主要过敏原分离纯化与鉴定
利用SDS-PAGE对实验室分离纯化的OVT、OVA和Lys以及购买的OVM的纯度及分子质量进行分析，结果显示，OVT分子质量约为76 kD，OVA分子质量约为43 kD，OVM分子质量约为28 kD，Lys分子质量约为14.3 kD。经Quantity One软件对电泳图进行分析，OVT、OVA、OVM和Lys的纯度均达到98%以上。
2
热加工后二级结构变化
未加热处理的OVT的光谱曲线，在192 nm处有一个正峰，208 nm和222 nm处呈负峰，这表明具有典型的α-螺旋结构；同时在195 nm有一个正峰，215 nm处有一个负峰，这是β-折叠的典型结构，说明未加热OVT具有α-螺旋和β-折叠结构。加热处理后，在208 nm和222 nm处的负峰峰值降低，在192 nm和195 nm处的正峰峰值也降低，且曲线波动较大。
与未处理的OVT相比，不同加热温度下的α-螺旋和β-转角含量之间均存在显着性差异（P＜0.05），加热破坏了OVT的二级结构。加热后α-螺旋含量降低，β-折叠含量增加，β-转角和无规卷曲发生不同程度的变化，进一步证实了OVT受热不稳定。
OVA热处理前后二级结构的变化：与未加热蛋白相比，100 ℃下加热不同时间，α-螺旋向其他二级结构形式转化；随时间的延长α-螺旋含量逐渐下降，但β-折叠的含量并无显着差异（P＞0.05），25 min时无规卷曲含量最多，说明此条件下蛋白质分子最为无序。在80 ℃下加热25 min，与未加热OVA相比，无规卷曲含量略有下降，分子的有序性增加。
OVM热处理前后二级结构的变化：80 ℃加热25 min、100 ℃加热20 min的二级结构含量与未加热的差别较大，但当条件达到100 ℃加热25 min时，结构含量又与未加工OVM相似，说明加热对OVM二级结构的改变是可逆的，OVM耐热性较强。
未加热Lys存在典型的α-螺旋和β-折叠结构，说明Lys为α＋β型蛋白质。与未加热Lys相比，加热均会使其二级结构发生显着变化（P＜0.05），α-螺旋和β-折叠含量降低，β-转角和无规卷曲含量升高。在100 ℃下，随着加热时间的延长，α-螺旋和β-折叠比例先升高后降低，β-转角和无规卷曲先降低后升高；而在相同加热时间下，除了α-螺旋的含量外，80、90 ℃的处理并没有造成其他二级结构含量有显着差异（P＜0.05）。加热能不同程度地改变Lys的二级结构，其中100 ℃加热25 min时变化最大，无规卷曲含量最高，二级结构遭到破坏的程度最大。
3
热加工后三级结构变化
未加热OVT的UV-Vis光谱在280 nm左右有特征吸收峰。随着加热时间的延长和加热温度的升高，OVT的UV最大吸收峰的吸光度逐渐升高，OVT分子逐渐展开，使得Trp和Tyr残基暴露在蛋白质分子表面。但值得注意的是，加热15 min和20 min的结果基本无差别，表明当OVT结构展开到一定程度后，从15 min到20 min的时间间隔并不影响其展开，当继续加热至25 min时，结构进一步展开。因此，OVT结构的展开程度与加热程度有关。
OVA的UV-Vis光谱图在280 nm处有特征吸收峰，与未加热样品相比，加热后最大吸收峰的吸光度降低。在100 ℃下，随时间的延长，最大吸收峰的吸光度先降低，超过15 min后又略微升高，但变化幅度并不大。加热时间相同，UV最大吸收峰的吸光度随温度的升高而呈现极显着性降低（P＜0.01），80 ℃时天然构象逐渐转变为S-构象，因为有序的二级结构增多，具有UV吸收的芳香族氨基酸残基部分由分子表面被包埋至分子内部；而随着温度升高到90 ℃甚至100 ℃，S-OVA变性，蛋白质分子发生聚集，可能掩盖了部分暴露于分子表面的Trp和Tyr残基，使得吸光度大幅度降低。
OVM的UV-Vis光谱在280 nm处出现特征吸收峰。加热后的样品在280 nm波长处特征峰的吸光度均增加，但持续加热后，吸光度略升高后又有所降低，说明加热使分子展开，后又发生部分聚集；同样加热25 min，90 ℃和100 ℃的条件对样品没有显着差异（P＞0.05），但比80 ℃更能引起三级结构的变化，使芳香族残基暴露于分子表面。
在280 nm处出现特征吸收峰。加热后Lys的最大吸收峰的吸光度比未加热的大，表明加热会使其结构展开。但是100 ℃加热15 min其吸光度与未加热基本相同，而继续加热至20 min，吸光度又升高，然后25 min后又略降低；80 ℃和90 ℃加热25 min后样品的吸光度都升高，且几乎完全重合，而当升高到100 ℃时，吸光度下降，表明加热使其结构展开，后又发生部分聚集，造成Trp和Tyr残基的部分包埋。
4
热加工后疏水性变化
与未加热相比，加热后OVT的荧光强度极显着增加（P＜0.01），且随着加热温度的升高和加热时间的延长，荧光强度逐渐增加，但100 ℃加热15 min和20 min的光谱曲线几乎重合，并没有明显变化（P＞0.05），这与UV-Vis光谱趋势一致。
与未加工OVA相比，加热后的荧光强度极显着增加（P＜0.01），λmax发生了不同程度的蓝移。随时间的增加，荧光强度的变化无明显规律。相同加热时间下，80 ℃比90 ℃和100 ℃所引起荧光强度变化更大。
OVM加热前后的外源性荧光光谱图：与未加热样品相比，加热后的OVM的荧光强度增加，这表明加热使蛋白分子展开，暴露出分子内部的疏水基团。100 ℃下，加热10 min时荧光强度变化最大，而随着时间的延长，荧光强度又有所降低，但15 min与25 min热处理后蛋白的光谱图并无明显差别（P＞0.05），且与天然OVM相近；同样地，80 ℃加热后荧光强度变化最大，随着温度的升高，荧光强度又有所降低，且90 ℃和100 ℃所引起的图谱变化并无显着区别（P＞0.05），这表明热处理达到一定的强度时，蛋白分子可能发生聚集，暴露出的部分疏水基团被掩埋。
从溶菌酶加热前后的外源性荧光光谱图中可看出，加热后样品的荧光强度增加，且λmax发生了不同程度的蓝移，这表明加热使溶菌酶的三级结构发生变化，分子变得松散，内部的疏水基团暴露。一般情况下，随着温度的升高和加热时间的延长，Lys的荧光强度增强，表面疏水性越大。
结 论
结果表明，卵转铁蛋白对热不稳定，随加热时间的延长和温度的升高，分子结构逐渐展开，芳香族残基和疏水基团暴露于分子表面；轻微加热使卵白蛋白分子的二级结构更加有序，吸光度减小，表面疏水性增大，随着加热程度的增大，其二级结构变得无序，分子发生聚集；加热后卵类黏蛋白的二级结构较为稳定，轻微加热其分子展开，吸光度和荧光强度增大，继续加热使蛋白分子部分聚集；热处理使溶菌酶分子的有序性下降，芳香族残基和疏水基团逐渐暴露，但随着加热程度的增加，蛋白分子发生部分聚集。
