来自湖南师范大学生命科学学院的王灿、莫湘涛和张峰等人采用响应面法优化EcNA菌株的培养基配方，既有利于菌株的高密度发酵、提高工程菌菌体浓度，又能推迟菌体老化时间、延缓抗肿瘤靶向工程菌株的功能，同时还能减少培养体积，缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本。采用抗肿瘤靶向工程菌高密度发酵，并优化菌体粉剂保护剂配方，期望得到显着提高菌体功能及其存活率的复合型保护剂。
1 培养基组分单因素试验结果
碳源及氮源的筛选结果
在发酵抗肿瘤靶向工程菌EcNA的过程中，培养基内加入可溶性淀粉对菌体浓度提高的效果最显着。
培养基组分单因素试验结果
随酵母抽提物、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、微量元素母液用量及接种量的升高，发酵后的菌体浓度均有上升。其中随着可溶性淀粉用量的升高，发酵后的菌体浓度呈下降趋势，当可溶性淀粉质量浓度超过8 g/L时，菌体浓度开始回升，但低于2 g/L时的菌体浓度，综合考虑发酵成本，选择2 g/L作为可溶性淀粉的较适质量浓度。
低质量浓度时，OD600 nm随酵母抽提物、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、微量元素用量及接种量的升高而增加，用量过高后，OD600 nm开始下降。
40 g/L酵母抽提物、3 g/L KH2PO4、12 g/L K2HPO4、0.3 g/L MgSO4、2 mL/L微量元素母液、3%接种量均能得到较高的OD600 nm值。
2 Plackett-Burman试验设计结果及回归分析
在试验设计的7 种考察因素中，酵母抽提物用量的P值小于0.01，对工程菌株OD600 nm的影响是极显着的，且E为正值，说明酵母抽提物在高水平时对该菌株高密度发酵有利。K2HPO4的P值小于0.05，对工程菌株OD600 nm的影响是显着的，其E为负值，说明K2HPO4用量在低水平时利于工程菌的发酵。酵母抽提物和K2HPO4用量为发酵培养基的两个重要影响因素。
3 中心组合试验结果
通过方差分析，可得到二次多项式回归方程为：Y=7.46＋0.07X1－0.16X2＋0.4X1X2－2.08X12－1.07X22。该模型的F值为93.14，P值小于0.000 1，模型的失拟项不显着，模型的决定系数R2为0.9852。相关调整系数R2Adj为0.9746。该二次方程能够较好地拟合真实的响应面，可用来预测工程菌株菌体浓度的变化。
酵母抽提物和K2HPO4在工程菌EcNA的发酵过程中存在交互作用。由响应面图可以看出，该模型存在极大值。对所得二次多项式回归方程取一阶偏导等于零，联立方程求解可得：当酵母抽提物用量50.3 g/L、K2HPO4用量14.26 g/L时，能得到OD600 nm的预测极大值为7.467。按此配方进行发酵验证，测得OD600nm为7.602，与预测值接近，说明了该方程的拟合性好。
4 冻干保护剂的优化
冻干保护剂单因素试验结果
可看出运用蔗糖、抗坏血酸钠和脱脂乳作为冻干保护剂能得到较高的菌体存活率。故选择蔗糖、抗坏血酸钠和脱脂乳进行下一步的正交试验。
冻干保护剂正交试验及方差分析
蔗糖、脱脂乳、抗坏血酸钠均对冻干菌粉存活率有显着影响，且影响因素顺序为：抗坏血酸钠质量浓度＞蔗糖质量浓度＞脱脂乳质量浓度。
根据正交试验结果，综合考虑称量误差，最终选定最优水平为蔗糖质量浓度3 g/100 mL、脱脂乳质量浓度14.25 g/100 mL、抗坏血酸钠质量浓度3 g/100 mL，并进行验证实验。此条件下，冻干菌粉的存活率达到（86.32±3.04）%。
结 论
最佳培养基成分为：可溶性淀粉2g/L、酵母抽提物50.3 g/L、K2HPO4 14.26 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 0.3 g/L、微量元素母液2 mL/L、接种量3%。发酵后溶液中菌体OD600nm 达到7.602，菌体生物量达到2.96×109 CFU/mL，比优化前提高了78.3%。以冻干保护剂在冷冻干燥过程中对工程菌株的保护效果为研究对象，通过正交试验得到制成菌粉的最佳保护剂配方为脱脂乳14.25g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL、抗坏血酸钠3g/100 mL，优化后菌体冻干粉存活率可达86.32%，利于制成延长贮存期的口服菌粉胶囊。
