来自吉林农业大学食品科学与工程学院的刘婷婷、刘阳和张晶等人采用碱溶酸沉法对分蘖葱头中蛋白质进行提取，正交试验法优化出最佳提取工艺条件，并对分蘖葱头蛋白基础特性进行深入的研究。为分蘖葱头蛋白的进一步开发应用研究提供了良好的理论基础。
1. 蛋白提取单因素试验结果
1.1 料液比对蛋白提取率的影响
料液比对分蘖葱头蛋白质提取率影响较大，料液比在1∶5～1∶25（g/mL）范围内变化时，蛋白提取率随着提取液用量的增加，呈现先升高后降低的趋势，料液比在1∶15（g/mL）时，提取率最大。在蛋白质提取过程中，适当的增加提取液的用量有助于蛋白质的溶出，可提高分蘖葱头蛋白提取率。但继续增加提取液用量，蛋白质溶出达到饱和，提取率趋于稳定，过多的提取液会使酸沉过程中酸的用量大大增加，致使成本增加。因此选取料液比1∶15（g/mL）为最适宜条件。
1.2 pH值对蛋白提取率的影响
当提取液pH值在8.0～10.0范围内变化时，随着提取液pH值的不断增加，分蘖葱头蛋白提取率呈现先上升后下降的趋势，在pH 9.0时，蛋白提取率达到最大。
1.3 提取温度对蛋白提取率的影响
当提取温度在20～40℃范围内变化时，随着温度的升高，蛋白提取率不断增加至最大，当提取温度在40～60℃范围内继续上升时，蛋白提取率呈现下降趋势。
1.4 提取时间对蛋白提取率的影响
提取时间在1～2h范围内变化时，随着提取时间的延长，蛋白提取率呈现上升趋势，在提取时间为2 h时，蛋白提取率最大，但随着提取时间继续延长，提取率趋于平缓。提取时间过短，蛋白质从原料中溶解不完全。但随着提取时间的延长，蛋白质溶出量达到饱和，因此继续延长提取时间，蛋白提取率不再有明显的增加。因此选取提取时间2 h为最适宜条件。
1.5 分蘖葱头蛋白提取工艺优化
对分蘖葱头蛋白提取率影响因素大小分别为pH值＞料液比＞提取温度＞提取时间。得到碱溶酸沉法提取的最佳工艺条件为A2B2C3D1，即料液比1∶15（g/mL）、pH9.0、提取温度50 ℃、提取时间1.5h，在此条件下蛋白提取率为79.38%，在此条件下，进行验证实验，蛋白提取率为80.12%，与正交试验优化得到的提取率相差不大。
1.6 正交试验方差分析
校正模型具有显着性，A、B、C、D各因素对提取率的影响P值均小于0.01，表明料液比、pH值、提取温度、提取时间4 个因素对分蘖葱头蛋白质的提取影响均极显着，因此上述4 个影响因素可作为提取过程中影响蛋白提取率的首要考虑因素，且该提取方法可用于分蘖葱头蛋白提取。
2. 蛋白基础特性测定结果
2.1 等电点测定结果
pH值在2.5～5.0范围内变化时，样品上清液吸光度呈现先下降后上升的趋势，在pH 3.0时吸光度最低，即上清液中蛋白含量最少，此时蛋白质沉淀完全，因此pH 3.0为分蘖葱头蛋白的等电点。
2.2 紫外-可见分光光度计测定结果
在波长270～700 nm范围内对蛋白溶液进行紫外-可见光谱扫描时，279 nm波长处出现最大吸收峰，且其他波长处曲线较平缓，未见明显杂峰，而蛋白溶液的紫外-可见光光谱的最大吸收峰在280 nm波长附近。由此可知提取的分蘖葱头蛋白纯度较高，且结合分光光度法测得纯度数据结果可知，冻干粉中蛋白纯度为80.02%，说明该方法提取制备分蘖葱头蛋白的方法可靠。
2.3 蛋白分子质量测定结果
分蘖葱头蛋白的分子质量在48～63、25～35、17～20 kDa以及11～17 kDa之间均有条带，在25～35 kDa条带颜色较深，根据标准曲线方程计算出分蘖葱头蛋白的分子质量可分为61.94、27.10、17.62、13.34 kDa 4 组。
2.4 氨基酸组分分析
分蘖葱头蛋白中必需氨基酸质量分数为38.96%，非必需氨基酸质量分数为61.04%，必需氨基酸和非必需氨基酸的比例为0.638，接近世界卫生组织规定值0.666，说明分蘖葱头蛋白氨基酸组成较为合理，并且赖氨酸含量较高，可弥补谷物蛋白中赖氨酸含量较低的缺陷。
2.5 蛋白二级结构的测定结果
通过CD-Pro软件计算结果可知，分蘖葱头蛋白质中α-螺旋含量为52.60%，β-折叠含量为8.60%，β-转角含量为15.60%，无规则卷曲含量为22.40%。主要结构为α-螺旋，含量最低的为β-折叠。
2.6 特征性官能团测定结果
波数在3 303 cm-1处出现了典型的—OH吸收峰，2 935 cm-1出现的峰是由—CH2—反对称伸缩振动产生的，在2 356 cm-1处的吸收峰是由CO2反对称伸缩振动引起的，1653 cm-1处的吸收峰是由蛋白质酰胺I带特征基团R—CO—NH2中—C＝O—伸缩振动产生的，1530 cm-1处吸收峰是由蛋白质仲酰胺基团中的—NH面内弯曲振动产生的，1390 cm-1处较弱的吸收峰由蛋白质中游离的COO—对称伸缩振动产生的，1249 cm-1处的吸收峰可能由—C(CH3)3中的C—C反对称伸缩振动产生的，后面出现的小杂峰可能是由于少量水分的存在而引起的。
结 论
在料液比1∶15（g/mL）、pH 9.0、提取温度50 ℃、提取时间1.5 h条件下提取率最大为79.38%。电泳结果表明蛋白分子质量分别为61.94、27.10、17.62、13.34 kDa。高效液相色谱法测得分蘖葱头蛋白中必需氨基酸质量分数为38.96%，非必需氨基酸质量分数为61.04%。二级结构测定结果表明分蘖葱头蛋白中α-螺旋含量为52.60%，β-折叠含量为8.60%，β-转角含量为15.60%，无规则卷曲含量为22.40%。采用红外图谱法对分蘖葱头蛋白特征官能团进行测定，其特征官能团明显。
