来自中国药科大学工学院的赵聪、程晨和尹诗语等人对基于亚铁螯合能力的灰树花蛋白酶解工艺进行优化，并评价了酶解多肽清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羟自由基能力以及总还原能力，以期为今后灰树花多肽的研究开发提供一定理论依据。
1. 蛋白酶的确定
6 种蛋白酶中，碱性蛋白酶水解产物亚铁螯合能力最强，胃蛋白酶亚铁螯合能力最弱，因此，选用碱性蛋白酶作为水解用酶。
在各个蛋白酶作用下，灰树花蛋白的水解度随酶解时间延长而增大。其中，中性蛋白酶和风味酶对灰树花蛋白水解度的影响明显大于其他4 种蛋白酶，水解度高达27.13%和15.12%，其他4种酶对灰树花蛋白的水解度最大值均在5%～10%内。
2. 单因素试验结果
2.1
pH值、加酶量对酶解效果的影响
亚铁螯合能力和水解度均随pH值增大而呈现先增加后降低趋势，最后在较高pH值下基本保持不变，二者具有一定的相关性。螯合能力在pH 8.5处达到最大值而水解度在pH 9时达到最大。
随着加酶量的增加水解度在不断增大，而亚铁螯合能力先增加后降低，在加酶量为1800 U/g时达到最大。随着酶量的增加，大分子灰树花蛋白迅速地分解成小分子多肽，水解度增加。
2.2
酶解温度、底物质量浓度、酶解时间对酶解效果的影响
在45～55 ℃温度范围内，亚铁螯合能力和水解度增加缓慢，当温度高于55 ℃后，螯合能力与水解度均随温度升高而降低。
当底物质量浓度为0.5～1 g/100 mL时，水解度和亚铁螯合能力基本保持不变，当底物质量浓度高于1 g/100 mL时，随着底物质量浓度的增加水解度和亚铁螯合能力逐渐降低，以此选择1 g/100 mL作为酶解最佳底物质量浓度。
亚铁螯合能力在1～1.5 h内随时间延长而呈线性增加，但超过3 h后，螯合能力下降。随着时间的延长，酶与底物接触时间增多，反应不断进行，水解度不断增加，使得小分子肽被进一步水解为游离氨基酸，亚铁螯合活性下降。因此，选择3 h作为酶解最佳时间。
2.3
酶解条件的确定
5 个因素对酶解效果的影响均显着。极差R值反应各因素对酶解反应的影响大小。各因素对碱性蛋白酶水解灰树花蛋白酶解效果的影响主次顺序为D＞A＞C＞E＞B，即底物质量浓度＞pH值＞酶解温度＞酶解时间＞加酶量，最佳酶解条件为A3B2C2D1E2，即碱性蛋白酶水解灰树花蛋白最佳工艺条件为pH 9、加酶量1800 U/g、酶解温度55 ℃、底物质量浓度0.5 g/100 mL、酶解时间2.5 h。验证实验结果表明在最佳酶解条件下，亚铁螯合能力为（1.854±0.025）mg/g，水解度为（6.14±0.05）%。
3. 灰树花蛋白亚铁螯合肽抗氧化能力结果
3.1
灰树花蛋白亚铁螯合肽对DPPH自由基和羟自由基的清除效果
随着灰树花蛋白亚铁螯合肽质量浓度的增加，DPPH自由基清除率明显增加，在多肽质量浓度为4 mg/mL时，清除率达92%。VC溶液对DPPH自由基清除率在质量浓度为0.2 mg/mL时即可达到最大值77%，此后清除效果基本不变。当多肽质量浓度高于3.2 mg/mL后，其清除率已高于VC，显示出更好的清除DPPH自由基能力。
灰树花多肽对羟自由基的清除率与质量浓度呈正相关，在4 mg/mL时清除率达到99.5%。虽然VC溶液在0.6 mg/mL时羟自由基清除率已达到99%，表现出更强的羟自由基清除效果，但4 mg/mL时灰树花多肽对羟自由基也具有较强的清除效果。
3.2
灰树花蛋白亚铁螯合肽总还原力的测定
随着VC溶液或灰树花蛋白亚铁螯合肽质量浓度的增加，吸光度升高，还原能力不断增加。但VC溶液的还原能力较灰树花多肽强。
结 论
碱性蛋白酶酶解物的亚铁螯合能力最强，在pH 9、加酶量1 800 U/g、酶解温度55 ℃、底物质量浓度0.5 g/100 mL、酶解时间2.5 h的条件下，灰树花蛋白亚铁螯合肽的亚铁螯合能力最强，可达1.854 mg/g，此时水解度为6.14%。灰树花蛋白亚铁螯合肽对DPPH自由基和羟自由基有较强的清除效果，且与多肽质量浓度呈正相关。结果显示，灰树花蛋白亚铁螯合肽具有良好的亚铁螯合能力，并具有较好的抗氧化活性，有望发展为新型的膳食补充剂。
