热休克蛋白（HSP）是生物界具有高度保守性的一类热应激蛋白质。根据分子质量的大小可分为小分子HSP（sHSP）、HSP60、HSP70、HSP90和HSP110。磷脂和HSP都是细胞尤其是细胞膜的重要组分，两者间关系密切。前期研究表明，HSP可以显着抑制磷脂酶A2对磷脂的水解作用，对磷脂水解以及肉品风味品质具有显着影响。
来自江苏省农业科学院农产品加工研究所的张玉梅、李鹏鹏和张牧焓等人从麻鸭中克隆HSP90α基因并构建原核表达载体，在大肠杆菌中可溶性表达并提取纯化HSP90α重组蛋白，测定其与磷脂结合及抑制磷脂水解的活性。旨在为解析HSP90α与磷脂绑定的特点提供工作基础，并为利用HSP90α绑定磷脂的性质、研究抑制肉品肌内磷脂水解和延缓脂质过氧化的新方法提供理论依据。
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麻鸭HSP90α基因的全长克隆及序列分析
以麻鸭骨骼肌细胞cDNA为模板，PCR扩增获得HSP90α开放阅读框全长为2 187 bp，扩增条带大小符合预期。预测HSP90α编码728 个氨基酸，分子质量为84.12 kDa，理论等电点为5.0。以人的HSP90α三级结构（PDB号：5FWK）为参考结构，预测鸭HSP90α的二级结构，显示有36%的氨基酸可能形成α螺旋，15%的氨基酸可能形成β折叠。
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HSP90α基因原核表达载体的构建
使用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ对表达载体pCold1和PCR获得的HSP90α基因进行酶切和连接，获得重组质粒。重组质粒经BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，获得4500 bp的大片段和约2 000 bp的小片段，分别与pCold1和HSP90α基因大小相符。进一步测序结果证实，插入位置、阅读框及重组基因序列均准确无误，表明目的基因已成功克隆至表达载体pCold1中，重组表达质粒构建成功，命名为pCold1-HSP90α。
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HSP90α基因原核表达载体的构建
将重组表达质粒转化到Transetta2感受态细胞，经0.25 mmol/L IPTG在22 ℃小量诱导表达12 h。离心收集菌体，超声破碎细胞。为探究融合蛋白的可溶性，将破碎后的菌体上清液、沉淀分别进行12%的SDS-PAGE，同时设置未加诱导剂的重组质粒菌液作为对照。结果发现利用该系统可以重组表达鸭HSP90α，蛋白大小约90kDa（带有His-tag）与预期大小一致，未加IPTG诱导剂的重组菌在预期大小的条带处没有明显的表达条带出现。另外，泳道4和泳道3对比，可以明显看出在22 ℃诱导条件下，大肠杆菌可以大量可溶性表达麻鸭HSP90α蛋白。
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重组蛋白的纯化
HSP90α重组蛋白的初步纯化
20 mmol/L咪唑洗脱可去除较多杂蛋白，50mmol/L咪唑洗脱可进一步去除杂蛋白，100 mmol/L和250 mmol/L的咪唑洗脱可得到较纯的HSP90α重组蛋白，表明通过此方法可以有效地纯化出大肠杆菌表达的HSP90α。收集100 mmol/L和250 mmol/L咪唑洗脱得到的蛋白用截留分子质量为10 kDa的超滤管进行浓缩，为下一步凝胶层析做准备。
HSP90α重组蛋白的凝胶过滤结果
样品经过Superdex G200层析柱纯化后得到5个洗脱峰，将不同的洗脱峰收集起来并用12%SDS-PAGE检测。结果显示，纯化后的融合蛋白条带比较单一，杂带消失，可去除大分子蛋白和部分小分子蛋白。其中1号洗脱峰为高纯度的目的蛋白HSP90α，将该洗脱峰收集起来浓缩后用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，分装后放－80 ℃保存待用。
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纯化融合蛋白的Western blot鉴定结果
在预期目标蛋白处出现非常单一的条带，并且大小与预期也一样，说明纯化得到的蛋白是预期的重组蛋白。
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薄层析法鉴定HSP90α与磷脂的结合活性
与对照组相比，随着在磷脂酰胆碱和HSP90α共孵育体系中加入的HSP90α量的增加，在展开剂中迁移的磷脂酰胆碱显色形成的斑点面积逐渐变小，其中加入15 μg HSP90α的实验组比对照组磷脂酰胆碱显色斑点的面积减小了约90%，变化显着。这表明HSP90α与磷脂结合，形成的绑定体显着抑制了磷脂在展开剂中的迁移。
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HSP90α对磷脂水解的抑制
随着反应中HSP90α浓度的增加，检测到的磷脂水解产物的荧光强度逐渐降低，与不含HSP90α的对照组相比，当HSP90α浓度为0.4 μmol/L时，磷脂水解产物明显减少（约13%）；当HSP90α浓度为6.4 μmol/L时，磷脂水解产物减少了约70%。这表明HSP90α与磷脂的结合使磷脂水解产物减少，HSP90α显着抑制了磷脂酶A2对磷脂的水解作用，可能是由于HSP90α与磷脂结合，使磷脂酶A2无法识别和攻击磷脂sn-2位的酯键，对磷脂起到了保护作用。
结 论
获得的HSP90α开放阅读框全长为2 187 bp，编码728 个氨基酸，预测的理论等电点约为5。构建的原核表达载体pCold1-HSP90α在大肠杆菌中成功可溶性表达了麻鸭HSP90α，并获得了高纯度的重组HSP90α蛋白。运用薄层层析证明该重组蛋白具有稳定结合磷脂酰胆碱的活性，并且该蛋白能显着削弱磷脂酶A2对磷脂的水解作用。该研究成功克隆并建立了麻鸭HSP90α基因的原核表达体系，制备了具有磷脂结合活性的重组蛋白，为进一步研究HSP90α与磷脂的相互作用及对肉品加工中磷脂的保护效应提供了理论支持。
