在氮源基础培养基中分别加入酵母浸出粉、蛋白胨、黄豆饼粉、酵母膏、氯化铵和硫酸铵 6 种氮源进行考察，结果如表 8 所示，凝结芽孢杆菌 BC01 对这 5 种氮源均可以利用，其中以蛋白胨和酵母浸出粉为氮源时其产孢率较高，分别达到了 37.5%和 59.5%；其他有机氮源产孢率偏低，而以无机氮源硫酸铵作为氮源时产孢率最低。可能是有机氮源是天然的营养物，富含多种营养成分及未知生长因子，能促进菌体生长。无机氮源相对营养成分单一，因此导致凝结芽孢杆菌将其作为氮源时的产孢率不高。综上所述，选择酵母浸出粉作为氮源。
Mn2+是微生物生长和芽孢形成所需的一种微量元素，可作为超氧化物歧化酶、黄嘌呤氧化酶和 L-阿拉伯糖异构酶等酶催化过程中重要的辅助因子，因此考察了不同锰离子浓度对活菌数及芽孢数量的影响。表 9 中的实验结果显示 Mn2+ 浓度对凝结芽孢杆菌芽孢的形成有显着影响，当 Mn2+浓度为 10 mg/L 时，芽孢数量达到最高 (2.5×108 CFU/mL)，是 5 mg/L Mn2+浓度下芽孢数的 3 倍，且产孢率可达 71.4%；此后随着 Mn2+浓度的增加芽孢数量呈下降趋势，当 Mn2+浓度达到 30 mg/L 时芽孢率仅为 21.4%。由此可见，Mn2+最适浓度为 10 mg/L。
根据上述实验结果选择糖蜜、酵母浸出粉、硫酸锰进行 3 因素 3 水平的正交试验(表 10)，正交试验结果见表 11。
正交试验结果表明，培养基各组分对芽孢产率的影响主次为 A>B>C，最优组合为 A2B2C2。通过单因素试验及正交试验得出的最佳培养基成分为：糖蜜 10.0 g/L，酵母浸出粉 20.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，K2HPO4 5.0 g/L，MnSO4 10.0 mg/L。
培养条件对产孢率影响的结果如图 3 所示。当接种量增加到 4%时，其产孢率达到最高(65.1%)，而进一步提高接种量后，产孢率不断下降(图 3A)，可能是由于菌体生长过快导致代谢产物大量积累，使培养基 pH 急剧降低所致。培养时间对产孢率的影响表现为：前 36 h 其产孢率呈上升趋势， 36 h 时达到最高(69.1%)；36 h 后由于营养物质缺乏、培养条件恶劣，菌体大量死亡，其产孢率也逐渐降低(图 3B)。初始 pH 值为中性时，其产孢率达到最高 64.2%，如图 3C 所示。由于凝结芽孢杆菌 BC01 为高温筛选所得，因此最适培养温度高于一般细菌，可达到45 °C，在该培养温度下菌株BC01 长势良好，产孢率最高可达 65.4%。综合以上结果，单因素最佳条件为接种量4%，温度45 °C，初始 pH 7.0，培养时间 36 h。
按照摇瓶实验优化获得的最佳培养基成分及培养条件，于 20 L 发酵罐中进行扩大培养，考察菌体生长、活菌数及芽孢个数，为进一步大规模工业化生产提供基础。按实验获得的最佳培养基组分配制培养基，即：糖蜜 10.0 g/L，酵母浸出粉 20.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，K2HPO4 5.0 g/L，MnSO4 10.0 mg/L。初始 pH 为 7.0，培养温度为 45 °C，起始通气量为 10 L/min，转速为 200 r/min，通过调节转速及通气量控制发酵过程中溶氧水平在 40%以上，培养时间为 48 h。发酵过程中取样测活菌数及芽孢数，并计算产孢率，结果如图 4 所示。
从图4可以看出，凝结芽孢杆菌BC01的芽孢接入发酵培养基后，0–4 h 为菌体生长的延滞期，4 h 后菌体生长迅速，活菌数快速上升，在 36 h 达到最高，为 6.7×109 CFU/mL，随后由于培养基营养物质的耗竭及代谢产物的积累，周围环境不利于菌体生长，菌体进入衰亡期并开始自溶，表现为活菌数逐渐降低。芽孢数在 12 h 时开始逐渐增加，产孢率随之上升；培养 30 h 后镜检可见芽孢成熟脱落，40 h 时达到最高，为 5.8×109 CFU/mL，相应产孢率最高达到 89.2%；40 h 后芽孢数逐渐降低，可能是因为部分芽孢复苏为菌体，从而导致芽孢数量的减少。实验结果表明，凝结芽孢杆菌 BC01 在 20 L 自动发酵罐中扩大培养效果良好，上述实验获得的最佳培养条件及培养基成分为进一步应用于工业化大规模生产奠定基础。
本实验根据凝结芽孢杆菌的相关特性，通过选择性培养基在特定培养条件下筛选并鉴定得到抑菌能力较强的凝结芽孢杆菌，并对其产孢条件进行优化，得到高产芽孢的发酵工艺，为其实现工业化生产提供参考依据。本研究通过营养限量和高温诱导的方式提高凝结芽孢杆菌 BC01 的芽孢率，这与徐世荣等和路程等的研究结果大致相同。
在实际生产中需要选择合适的碳、氮源，并注意限量添加。很多研究表明 Mn2+ 可以提高菌株的芽孢形成率，本研究的实验结果也符合上述结论。本研究虽然筛选到可用于微生态制剂的凝结芽孢杆菌，但是其功能性如何还需要后期通过动物实验来验证。
