1.实验试剂
(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1％SDS
(2)3M NaAc
(3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA
(4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)异丙醇
(7)无水乙醇
(8)75%乙醇
(9)RNaseA
2.实验步骤
(1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
(2)加入4mL提取液,快速振荡混匀
(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3～5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)
(4)1000rpm,4℃,5min
(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)
(6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中
(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃处理1h
(9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
(10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
(11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用
二、真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次
3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min
4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃处理1h
8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用
DNA提取缓冲液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc方法一和二,是大同小异.主要是DNA提取液配方不一样！成本也不一样！
三、真菌菌丝的总RNA的提取
1.实验试剂
(1)RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入).由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可
(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA
(3)10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌
(4)3M NaAc
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(7)DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌
(8)无水乙醇;70%酒精
2.实验步骤
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
注意：提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短.
