期刊：Nature Medicine
IF：29.886
发表时间：2016年
通讯作者：Jose C Clemente
摘 要 最近的研究已经表明了宿主遗传、产前环境和分娩方式如何塑造新生儿出生时的微生物菌群。在此之后，抗生素治疗、饮食或环境接触等产后因素将进一步影响婴幼儿微生物菌群的演变和免疫系统的发育，新生儿早期接触各种微生物有机体一直以来被猜测对其有保护作用。此外，流行病学研究表明，能够改变婴儿时期细菌群落的因素，将会增加婴儿在儿童时期患病的风险，强调了早期微生物组成的重要性。在这篇综述中，我们阐述了产前和产后因素如何影响微生物组成和免疫系统的构建，同时讨论了微生物介导疗法的前景和更为有效的方法去重新调整细菌群落，使其从致病性恢复到自我平衡状态。
综述结构
引言
在过去的几年里，我们对微生物组的了解大大增加了，越来越多的证据表明，早期的异常细菌群落可能通过改变免疫系统的构建而导致疾病。流行病学研究已经证实，破坏婴儿时期微生物群的因素、免疫和代谢条件之间有明确的相关性。然而，直到最近，我们才了解了婴儿时期微生物群落的组成，以及打乱群落分布可能如何导致疾病。最近的研究也描述了改变微生物组成的干预措施，开辟了克服婴儿时期微生物失衡作为一种预防性治疗方法的可能性。
我们将阐述新生儿多个身体部位的微生物群落，但是本文中的主要重点在肠道中发现的微生物群落。在整个论述过程中，使用“生命早期”来表示生命前2年的时期。年龄小于4周龄的孩子将称为“新生儿”，4周龄以上的孩子称为“婴儿”或“小孩”，一般来说，青春期年龄以下的称“儿童”。首先概述影响婴儿出生时及刚出生后微生物组成的主要因素，包括分娩方式，抗生素，饮食和周围环境，然后描述早期生命微生物的组成是如何在免疫系统的建立过程中起决定性作用的，以及如何失衡可能在生命后期诱发疾病。最后，总结目前早期生命微生物与疾病之间关系的论证，讨论干预改变微生物组成的治疗前景。
1 新生儿出生时的微生物
1.1 产前因素
1.2 分娩
2 影响生命早期微生物的因素
2.1 抗生素
2.2 饮食
2.3 益生菌和膳食补充剂
2.4 环境接触
2.5 宿主遗传
1-2部分已经于第一篇微文中分享，可点击以下链接查看：综述 | 生命早期微生物对健康的意义（第一部分）
3 新生儿微生物群在免疫系统构建中的作用
宿主微生物群与免疫系统之间的平衡对致病后的自我恢复和防止异常炎症至关重要（图2)。多项研究报道，婴幼儿的肠道微生态失调与慢性炎症相关，如肥胖，IBD或成人期的牛皮癣。
在顺产过程中，婴儿从母亲的阴道、皮肤组织、粪便中获得到他们最初的细菌接种物，使新生儿未成熟的免疫系统暴露于过量的细菌环境中。新生儿先天性免疫系统偏向于TH2表型，其与检测到的蠕虫和寄生虫相关，但也与过敏反应的诱导有关，并且偏向于TH1细胞极化细胞因子以避免潜在的不良促炎症反应，从而使微生物存在于原来的位置并定植。这种免疫反应受损使免疫抑制，从而使新生儿更容易致病。因此，经常在不同时间和年龄段多次经历致病性遭遇，会使免疫系统从TH2向TH1过渡（图2），减少新生儿患过敏性疾病及成年时患过敏性疾病的机会。相反，婴儿肠道处于微生态失调的状态，会强烈地促进免疫系统向TH1偏倚，推动免疫系统促炎症反应，分泌细胞因子IL-12和干扰素（IFN）-g。处于这种炎症状态会促进组织损伤、增加感染率、降低组织修复能力，干扰正常的免疫调节系统，从而可能导致长期的不良后果，如患IBD，过敏和自身免疫性疾病。
包括派伊尔氏淋巴集结和肠系膜淋巴结在内的二级淋巴结构在细菌定植之前在产前发育。肠道微生物定植后共生细菌和宿主免疫系统之间发生相互作用。派伊尔氏淋巴集结顶端表面的微皱褶细胞（M）通过胞吞作用对腔内抗原和细菌发挥免疫作用，之后树突状细胞（DCs）呈递这些抗原以诱导T细胞依赖的B细胞成熟，促进分泌二聚体IgA，其在固有层的浆细胞中起着防御病原体的关键作用。细菌也可以通过固有层中的DCs进行胞质转运，并在排出的肠系膜淋巴结中呈递给T细胞以诱导T细胞分化。在稳态环境中（左下），与共生细菌有关的MAMP通过刺激肠上皮调节性细胞因子产生（IL-25，IL-33，胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）和转化生长因子（TGF）-b）细胞，将信号转导至DCs，诱导Treg细胞的发育并促进IL-10分泌，在营养不良状态（右下），共生细菌的减少导致病原体和病原体富集。由肠上皮细胞感知的致病MAMP诱导促炎症细胞因子（IL-1，IL-6和IL-18）的分泌，促进效应T细胞的发育,这些效应T细胞分化成CD4 + TH1和TH17细胞，其分泌促炎性细胞因子如IL-17，肿瘤坏死因子（TNF）-α和IFN-g，这些细胞因子诱导嗜中性粒细胞富集使宿主抵抗致病性感染。派尔氏斑块中的B细胞成熟导致产生IgG，其通常与宿主自身免疫和变态反应相关。
最近在新生小鼠中进行的一项研究表明，小鼠免疫耐受性（缺乏对特定抗原反应的能力，这些抗原能够使免疫系统区分“自我”与“非自我”组织）是在顺产过程中获得的，而不是通过剖宫产获得的。顺产小鼠能够自发激活肠上皮细胞，并且对脂多糖（LPS)具有抗性，这种脂多糖是在婴儿出生后不久，引起宿主免疫应答的革兰氏阴性细菌膜中发现的分子。从而通过对感染免疫应答基因的下调产生耐受性。有研究在对芬兰、俄罗斯卡累利阿和爱沙尼亚的222名婴儿研究中，进一步探究了脂多糖和肠道微生物的组成对早期生命的作用。芬兰和爱沙尼亚婴儿肠道微生物组成以拟杆菌为主，因此这些婴儿接触到的脂多糖主要来源可能是这种细菌属，然而，俄罗斯婴儿肠道中拟杆菌的丰度明显较低。研究发现来自拟杆菌的脂多糖在结构上，与来自其他细菌的不同，更特别的是，它还在体外和非肥胖糖尿病（NOD）小鼠中能够抑制其耐受性。这些发现表明芬兰和爱沙尼亚婴儿患自身免疫性疾病概率较俄罗斯卡累利阿婴儿高。
然而，不同种类的拟杆菌可以引起不同的免疫反应。例如，脆弱拟杆菌通过作用于调节性T（Treg）细胞已被证明具有抗炎作用。脆弱拟杆菌产生表面多糖A（PSA），这种多糖是在Treg细胞上被Toll样受体2（TLR2）识别的一种微生物相关的分子模型（MAMP）。TLR2和PSA诱导Treg细胞并限制TH17反应，由此促进肠道和免疫的耐受性。然而这种保护作用仅见于新生儿肠道免疫的发育中，在成年小鼠中并未发现。
4 新生儿微生物与疾病
4.1 早期生命微生物与疾病之间的关系
如上所述，新生儿的异常微生物群与儿童时期及以后患病相关。例如，在初始治疗患有克罗恩病（CD）的儿童中，发现与健康儿童（肠道中的拟杆菌属，铁杆菌属或瘤胃球菌属的丰度较高）相比，患有CD的儿童肠道中富集韦荣球菌科、奈瑟氏球菌科及梭杆菌科。
哮喘的发病率也与婴儿的肠道异常微生物相关。在对319名婴儿肠道微生物的纵向分析中，发现尽管各组间儿童肠道中细菌多样性和组成差异不明显，但在1岁时，同时患有特应性过敏性疾病与哮喘的婴儿肠道中Fecalibacterium、毛螺菌属、罗思氏菌属和韦荣球菌属的含量与3月龄相比较，明显降低了。根据计算预测，研究证实，在3个月龄时，LPS生物合成减少，短链脂肪酸乙酯的生成也减少。
最近针对对牛奶过敏的226名婴幼儿研究中发现，3至6月龄的婴儿肠道微生物组成与牛奶过敏相关，且一直持续到8岁，而不是7至12月龄或13至16月龄大幼儿。当小于6月龄婴儿不再对牛奶过敏的时候，其肠道中梭状芽胞杆菌和厚壁肠壁菌较丰，然而其能够长时间在肠道中定植与高丰度的肠杆菌、沙门氏菌及Trabulsiella相关。较小年龄的婴儿肠道中微生物组成发生这样的变化，通常伴随着细菌代谢脂肪酸的降低，这与观察到的健康婴儿肠道中链短脂肪酸水平低于牛奶过敏婴儿的结果一致。这项研究和其他研究表明，生命早期肠道微生物群即使被短时间的破坏，在婴儿以后的生活中也会引起不同的变化。
用无菌小鼠进行研究，可以更精确地确定微生物如何失衡导致疾病。例如，Fecalibacterium sp、毛螺菌属、罗思氏菌属和韦荣球菌属 （FLVR）在患有特应性过敏性疾病和哮喘的婴儿肠道中显着减少。将这些细菌接种于患有气道炎症模型的无菌小鼠中，发现炎症有所改善，类似地，将马拉维双胞胎中，与营养不良相关的微生物移植到无菌小鼠体内后，小鼠的体重下降了。Noval-Rivas及其同事还发现食物过敏模型小鼠的肠道微生物组成不仅与野生型（WT）小鼠不同，而且将食物过敏模型小鼠肠道微生物接种到野生型无菌小鼠时甚至可以促进小鼠对食物的过敏反应。总之，至少在动物模型中，这些研究结果清楚地表明了早期生命中的异常微生物和疾病之间的因果关系。
4.2 微生物介导的疗法
改变微生物组成的方法通常可以分为三大类：减少、调节、置换或修复。 例如，抗生素通常用于治疗不一定由特定病原体引起的病症，原因是其具有有效减少肠道微生物的能力（图3）。在治疗婴幼儿IBD中，有时通过单独或联合使用抗生素来治疗疾病，然而，婴幼儿时期长期使用抗生素会带来很大的风险。
细菌含量也可以通过饮食干预来调节，从而阻止有害细菌的繁殖或促进有益细菌的生长（图3）。肠内专用营养（EEN）是一个臭名昭着的例子， EEN由液体营养素组成的配方替代普通膳食成分，通过口服或喂食管喂养婴幼儿。EEN被用作小儿克罗恩病的一线疗法，能够诱导临床症状缓减并使炎症标记正常化。在最近一项对23名16岁以下CD患者的的研究中，15名患者接受EEN治疗8周后，在改善了疾病状况的同时反常地增加了与健康对照者之间的肠道微生物组成差异。这个意外的结果表明，此治疗机制可能使结肠细菌含量水平降低和潜在有害细菌代谢物浓度较低。尽管EEN在治疗儿科克罗恩氏病中取得了的成功，但是低适用性和低效的喂养方式（喂食管）使得长期使用EEN 非常困难。
在临床前阶段，该疾病尚未显现，症状不明显，但微妙的生物学变化可能已经发生。诸如使用特定的细菌作为接种物防止早期肠道微生物失调导致疾病发展的方法，在疾病的早期阶段可能是最有效的。随着疾病的发展，体内微生物群的破坏导致病原生物富集（如红色所示），产生促炎症代谢物和炎症通路激活（图2）。保护上皮的粘液层由于疾病严重程度的增加而累积损伤变得更薄。在这个阶段，饮食干预和抗生素可能被用来极大程度地控制细菌的含量。在晚期阶段，持续的损伤导致粘液层进一步变薄，从而使细菌穿透上皮屏障。积极的抗生素治疗结合粪便微生物移植可以使微生物平衡恢复在这一点上。
营养不良的研究提供了婴儿时期饮食缺陷如何塑造肠道微生物群的极端例子。史密斯和他的同事研究了317名马拉维双胞胎生命前三年的肠道微生物组成。在研究过程中，发现43％的双胞胎因营养不良，其肠道菌群不平衡。虽然健康双胞胎的肠道微生物群逐渐呈现出成熟的趋势，但是给予营养不良的双胞胎专门治疗营养不良的药物后，其肠道微生物的组成也未能向健康双胞胎婴儿肠道微生物组成的状态发展。这些结果表明，目前的饮食干预措施可能无法有效地将微生物转化为非致病性状态，因此迫切地需要进一步的研究以揭示不同饮食如何改变肠道微生物含量和健康状况。
高度营养不良的环境可能需要更激烈的方法来改变肠道微生物的含量。粪便微生物群移植（FMT）旨在用外源性微生物替换本来存在肠道中的微生物（图3）。FMT在难治性艰难梭菌感染的治疗中非常有效（CDI），并且在治疗儿童和青年人（7至21岁）溃疡性结肠炎方面有所探究。然而，该疗法在其他情况下的疗效低于在治疗CDI中的疗效，需要进一步的研究优化提高FMT治疗的因素（如剂量，给药途径和剂型）。此外，FMT的使用仍处于监管调整过程中，整个肠道菌群最终将被设计好的细菌群落所取代的前提是设计的微生物群落具有相当好的功效。在婴幼儿肠道微生物移植的研究中，设计和实施都十分具有挑战性，但是考虑到儿科IBD等疾病的治疗选择有限，预测这将是一个非常有趣的应用。鉴于早期微生物群对健康的影响，旨在恢复肠道微生物平衡的预防性治疗是非常理想的（图3）。最近的研究证明了，剖宫产婴儿肠道中异常的微生物可以部分恢复至类似于顺产婴儿肠道微生物的状态。用分娩前一小时引入产妇阴道内的纱布擦拭剖宫产婴儿，其皮肤、口腔和肛门富集乳杆菌属或拟杆菌属，且这些剖宫产婴儿肠道中的微生物群与顺产婴儿微生物群非常相似。这表明将阴道细菌转移到缺乏这些菌的新生儿肠道中是可行的，尽管此过程对健康的影响尚未确定。
5 结论与展望
生命早期中的异常肠道微生物群与患疾病风险增加相关，但是我们仍然缺乏确凿的证据证明这些异常的细菌群落实际是病原体。超越单纯与特定细菌联系的机械学研究将提供更多有价值的信息而被人类所获悉。然而，肠道菌群早期定植对晚期定植的影响只能了解部分。成年动物研究已经显示了如何通过将膳食纤维发酵成可以诱导结肠中Treg细胞的短链脂肪酸来调节免疫反应。因此需要类似的研究深入了解不同微生物群落在早期生命中如何影响免疫系统的构建。
值得注意的是，在研究设计和分析过程中，微生物组的个体差异往往被忽视。纵向研究中，每个研究对象作为自身对照可以改善这个问题，需要寻找更有效的方法分析已有的微生物数据。此外，关键的是鉴定新生儿微生物群在肠道以外器官中的变化，从而更好地认识影响这些身体部位病症的发病机理。
我们认为，目前仅通过测序来估计微生物组成的方法需要结合其他技术来量化细菌，并区分活细菌和死细菌。细菌免疫反应的强度取决于细胞活力，获取细胞活力的方法将提供微生物如何塑造免疫和影响健康的更加丰富的见解。研究不仅仅局限于细菌类别，还涉及功能特性和机制。转录组学不仅可以提供样本中的细菌和细菌基因的信息，而且还可以为宿主的转录活动提供信息。代谢组学也可以帮助确定细菌代谢物如何促进与宿主的相互作用以及它们如何影响宿主的健康状况。
不同人群肠道中微生物的群落结构和多样性也有很大差异。事实上，大肠杆菌或幽门螺杆菌菌株在不同人群中显着不同。另外非致病细菌菌株之间的基因组差异也与其导致的疾病差异相关联。明确来自不同人群的新生儿接触到的不同的细菌对进一步阐明破坏微生物相关的条件至关重要。预计微生物干预可能预防或改善与早期生命中异常微生物相关的疾病。为实现这一愿景，改变细菌群落的方法将不得不完善。调节人类微生物的研究只能在有限的时间内完成，因为细菌群落在干预停止后通常会迅速返回基线。此外，饮食干预可以快速改变微生物含量但对健康没有意义。因此，不清楚这些改变需要多长时间才能永久改变微生物组成并改变病程。最近，粪便菌群移植治疗溃疡性结肠炎的研究结果似乎表明在成人治疗中，短期的干预措施可能没有价值。因此，测试微生物干预不同时间，不同剂量或不同输送途径的研究，将是决定生命早期可塑性细菌群落如何变化，以及为了治疗目的如何对其进行修饰的基础。虽然这些问题都是需要大量的努力才能得到回答的复杂问题，但是目前对婴儿时期微生物群特征化，取得了迅速的进展，这将有助于治疗生命早期异常微生物导致的疾病。
